冰川棘豆(Oxytropis glacialis)根系土壤细菌多样性特征

曹鹏熙,刘怡萱,许国琪,姬亚丽,李敬科,李小燕,刘 星,,*

1 西藏大学理学院,拉萨 850000

2 武汉大学生命科学学院,武汉 430072

青藏高原地处地球“第三极”,具有高寒、低氧、强辐射及昼夜温差大等特点,使其生态类型独特,富含特殊的生物资源[1,2],植物和土壤微生物长期在这种极端环境的胁迫下,构建了一套复杂而稳定的互作系统,反映了植物和微生物的适应策略[3]。最新研究发现,青藏高原整体变暖的趋势会使土壤微生物活动增加,并引起植物纬度转移,导致整个高原面的陆地生态系统发生显著性变化[4],同时,青藏高原土壤微生物、植物和动物多样性与高寒生态系统的功能呈正相关,土壤细菌和植物多样性共同对生态系统多功能性变异的解释度为45%[5]。青藏高原作为全球生物多样性研究的热点地区之一,有关植物根部的微生物群落多样性特征,及微生物群落如何受到土壤理化因子的调节受到关注较少,尤其针对高寒草原有毒有害植物。

冰川棘豆是棘豆属(OxytropisDC)植物,为青藏高原特有种和广布种[6],多年丛生草本,茎极缩短,生长于海拔4500-5400m的砾石山坡、山坡草地、河滩砾石地和砂质地,主要分布于西藏阿里和那曲等地[7]。冰川棘豆全株有毒,属于疯草的一种,内含一种名为苦马豆素(Swainonine,Sw,1,2,8-trihydroxyoctahydro indolizidine)的毒性生物碱,干枯后仍然保留毒性作用,动物摄食后会导致其中枢神经系统功能紊乱[8],给当地的畜牧业带来严重影响。同时,冰川棘豆也是高寒草原和荒漠主要伴生种之一,可以在局部环境或者退化草地中形成优势种或亚优势种,对青藏高原草地退化以及土地荒漠化产生严重影响[9]。目前关于冰川棘豆的研究多集中于生态毒理、生物碱和内生菌等方面,赵宝玉等[10]人对西藏阿里地区的冰川棘豆分布面积、生物学特征、危害情况以及动物中毒特征进行了全面调查,李勤凡等[11]对冰川棘豆中生物碱进行了提取并鉴定为苦马豆素,余永涛等[12]已经从冰川棘豆中分离出了产苦马豆素内生真菌棘豆埃里格孢菌,张峰华等[13]对冰川棘豆产苦马豆素内生真菌相关的调控基因和酶进行了筛选,但是对青藏高原冰川棘豆根系土壤微生物的研究几乎是空白。冰川棘豆根系土壤是否存在提高植物抗寒、抗旱、抗辐射、耐盐碱和抗缺氧机制的微生物种群有待研究,冰川棘豆是否通过根系分泌物影响根系土壤微生物种群结构,使其成为局部环境中的优势群落也待验证。

本研究以青藏高原不同生态环境的冰川棘豆根系土壤细菌为研究对象,分析了不同生态环境中冰川棘豆根系土壤细菌的群落多样性及其与土壤理化因子的关系,阐述了其空间分布规律,探讨了根系土壤细菌对冰川棘豆在高寒生态系统中形成优势种可能的影响。

1 研究区域与材料方法

1.1 研究区域概括

本研究地理位置信息见表1。羊八井镇位于地热资源丰富的羊八井盆地,措勤县扎日南木措位于青藏高原北部羌塘国家级自然保护区,扎布耶措是中国最大的钾盐湖,珠峰大本营位于珠穆朗玛峰国家级自然保护区核心区,上述地区是冰川棘豆的主要分布区,属于高原寒带和亚寒带季风半干旱气候[14],本次科学考察取样获得西藏自治区林业厅及各自然保护区主管部门批准。

表1 采样点信息

1.2 样地设置与取样方法

本研究于2017年8月冰川棘豆生长旺盛期进行采样,每个样点3个重复,每个重复间隔100 m以上,共采集11份样本,其中ZBY样点因样本采集困难,只采集了2个样本。采样时,将冰川棘豆整株挖起,抖动脱落土,脱落土用无菌袋封装,用于土壤理化性质测定。将根表面粘附的土壤洗脱至 95%乙醇中,放入-20℃车载冰箱(美固Mobicool,CF- 50)中带回实验室置于-80℃超低温冰箱(江苏盛蓝,DW86L- 158)冷冻保存,用于土壤细菌总DNA提取。

1.3 土壤理化性质分析

按如下方法对有机物(organic matter,OM)、速效钾(available K,AK)、速效磷(available P,AP)、铵态氮(ammonium N,AN)、pH、电导率(electrical conductivity,EC)和含水量(soil moisture,SM)等土壤理化因子进行检测,含水量用烘干法测定,称取5 g新鲜脱落土于培养皿,置于(105±2)℃恒温干燥箱(上海精宏,DK- 420S)中烘干8 h；pH用电位计法测定(哈纳HANNA,HI98103),水土比为1∶1；电导率用电导仪法测定(哈纳HANNA,HI98304),水土比为3∶1；有机物、速效钾、速效磷、铵态氮用便携型土壤成分测定仪(北京优普通用,UPA-B506)测定[15]。

1.4 根系土壤细菌总DNA提取及测序

采用SDS加酶法提取根系土壤细菌总DNA[16],用NanoDrop One(Thermo,NanoDrop One)检测DNA纯度和浓度,用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)与806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rDNA V3-V4区进行PCR扩增[17]。PCR采用 20 μL反应体系,其中10×Bufferv 2 μL,2.5 mM dNTPs 2 μL,双向引物各(5 μM)0.8 μL,rTaq 聚合酶0.2 μL,BSA 0.2 μL,模板DNA 10 ng,补ddH2O至20 μL。PCR反应参数为：95℃ 3 min；95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 45 s,25个循环；72℃ 10 min,10℃停止试验[18]。用NanoDrop One检测PCR产物纯度和浓度,样本送至广东仁秀测序公司(Rgenome,China) 通过Illumina HiSeq平台进行高通量测序。

1.5 数据分析

使用FLASH软件(FLASH v1.2.7)对每个样本Illumina HiSeq测序得到的双端序列进行拼接,得到原始的操作分类单元OTUs(Operational Taxonomic Units)数据(Raw Tags)。用Trimmomatic(v0.33)软件对拼接后的Raw Tags质量和效果进行质控过滤,得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。所得Clean Tags数据在美吉公司I-Sanger云平台(www.i-sanger.com)上进行分析。利用Usearch(vsesion7.0)软件在Silva(Release128 http://www.arb_silva.de) 数据库基于97%相似度下对OTU聚类分析和物种分类学分析。利用ANOSIM相似性分析和Adonis置换多因素方差分析对四组样本进行分析,判断分组的可行性和可信度,然后基于最小样本序列数进行了抽平。Alpha多样性方面,利用mothur (version v.1.30.1)对Ace、chao、coverage、shannon和simpson五个指数进行分析,用T检验分析指数差异,用R作图。菌群结构组成方面,通过柱形图表示细菌群落组成；通过Venn图比较分析,在属的水平上确定四组样本共有的优势菌群；通过One_way ANOVA单因素方差分析各组样本属水平的差异物种组成,P值多重检验校正设置为Fdr、Post-hoc检验scheffe显著水平值为0.95。菌群结构关联与模型预测方面,采用Network共现性网络分析和相关性网络分析进行分析。土壤理化因子与菌群的关联分析方面,检测了OM、AK、AP、AN、pH、EC和SM,进行了CCA典型分析；基于Spearman等级相关系数,绘制了丰度前50的属与土壤理化因子的相关性Heatmap图。利用AI(Adobe Illustrator CS6)和PS(Adobe Photoshop CS6)软件对图片进行了组合处理。

所有的测序原始数据已提交到GenBank项目登录号PRJNA506831和NCBI SRA(Sequence Read Archive)登录号SRP170620下。

2 结果与分析

2.1 测序结果及Alpha多样性统计分析

2.2.1测序结果

通过高通量测序共得到725599条原始序列,质控后得到531512条高质量序列,平均每个样本48319条,在97%的相似水平下注释得到的OTUs数量为8743,统计共得到35个门,94个纲,195个目,368个科和712个属。平均Coverage覆盖率为96.2%,Shannon稀释曲线均趋于平缓(图1),说明本研究的测序数据合理,更多的测序数据只会产生少量新的物种OTU,基本能反应样本中细菌的群落结构组成。ANOSIM相似性分析显示组间差异大于组内差异(R=0.6444),分组是可行的；Adonis置换多因素方差分析显示分组可信度高(P=0.001)。

图1 Shannon稀释性曲线及多样性指数差异

2.1.2Alpha多样性统计分析

从表2可以看出,Ace和Chao丰富度指数以YBJ的最高,ZBY的最低,菌群丰富度排序为：YBJ>CQ>ZF>ZBY；Shannon和Simpson多样性指数以CQ最高,ZBY最低,菌群多样性排序为：CQ >YBJ >ZF>ZBY。组间指数T检验结果显示(图1),YBJ、CQ和ZF样本的多样性组间差异不明显,ZBY与其他组多样性组间差异显著。YBJ和ZBY之间有显著差异(P<0.05),其他组间Shannon指数差异不显著(P>0.05)。

表2 冰川棘豆根系土壤细菌的物种丰富度和多样性指数

表中多样性指数数据为：平均值±标准偏差；OTUs：操作分类单元(Operational Taxonomic Units)；Ace：Ace指数；Chao：Chao指数

2.2 冰川棘豆根系土壤细菌群落物种组成分析

2.2.1门和属水平的根系土壤细菌群落结构

根据分类学分析结果,除0.79%的未确定类群外,其余样本共注释到共35个门(图2),平均相对丰度在前1%的门比例为95.14%,包括变形杆菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和螺旋体门(Saccharibacteria)。经统计,除Hydrogenedentes在CQ特有,FCPU426,Lentisphaerae,Candidatus Berkelbacteria,BJ_169在ZF特有,其他门在四组样品中均有分布。

在属的水平分析结果显示,所有样本共注释到712个属(图2),平均相对丰度在前1%的物种分布在9个门的23个属,占所有属42.81%的比例。YBJ以Sphingomonas(7.26%)、Solirubrobacter(4.78%)和Planctomycetaceae(4.47%)为主；ZF以Prevotella9(7.98%)、RB41(5.09%)和Acidobacteria(4.92%)为主；ZBY以Arthrobacter(12.45%)、Micrococcaceae(5.86%)和Sphingomonas(5.33%)为主；CQ以Acidobacteria(6.41%)和G30-KF-CM45(4.29%)为主。YBJ特有属为Acidiphilium,Rhodovarius和Dokdonella等；ZF特有属为Geobacter,RuminococcaceaeUCG_013和BacteroidalesS24_7等；ZBY特有属为Azotobacter,Nibribacter,Agromyces,Rufibacter和Deinococcus等；CQ特有属为Limnobacter,CA002和NB1-j等。其中Arthrobacter在ZBY为主要优势菌属(12.45%),在YBJ(0.40%)和CQ(0.14%)少量分布,在ZF样本中无分布。Venn显示四组样本共有属257个(36.20%),YBJ样本特有属43个(6.06%),ZF样本特有属28个(3.94%),ZBY样本特有属23个(3.24%),CQ样本特有属79个(11.13%)(图2)。

2.2.2根系土壤菌群落组间差异分析

在属的水平上,对在四组样本间相对平均丰度差异较大的15个物种进行的单因素方差分析(One_way ANOVA)及post_hoc检验结果表明(图2),四种生态类型下Solirubrobacter、TK10、0319_6M6和Elev16S_1332存在极显著差异(P<0.01),Micrococcaceae、Saccharibacteria、JG30KF_CM45、Gaiellales、Acidimicrobiaceae、Blastococcus、Solirubrobacterales、Frankiales、Bradyrhizobium、Patulibacter和Parcubacteria存在显着差异(P<0.05)。

图2 基于门和属水平的细菌群落结构及属水平的venn图

2.3 冰川棘豆根系土壤细菌群落结构关联与模型预测分析

2.3.1共现性网络分析

对所有样本进行共现性网络分析显示,样本与物种共有1455个有效节点(Degree) (图3A),YBJ、ZF、ZBY和CQ样本分别有319、411、340和385个节点,与四组样本均共线的属中约30.70%,至少有67.28%的属在两组以上的样本中共线。四组样本中有7个属共线率超过2%,包括Sphingomonas(4.79%)、Acidobacteria(4.02%)、Arthrobacter(3.28%)、Micrococcaceae(3.03%)、Prevotella9(2.42%)、Planctomycetaceae(2.22%)和RB414(2.07%)；有17个属共线率超过1%,包括KD4_96、Acidimicrobiales、Lactobacillus、Solirubrobacter、Saccharibacteria、Comamonadaceae、Sphingomonadales、JG30_KF_CM45、GittGS_136、Iamia、Gemmatimonadaceae、Gaiellales、Segetibacter、Rubellimicrobium、TK10、Gaiella和Nitrosomonadaceae。以上共线率大于1%的24个属,确定为冰川棘豆根系土壤细菌群落的核心菌群。

2.3.2相关性网络分析

相关性网络分析发现(图3B),在网络中共显示有37个节点和212条边,说明冰川棘豆根系土壤细菌群落存在高水平的连接性。丰度大的物种在相关性网络中不完全占主导地位,整体群落的协同作用大于拮抗作用,Latescibacteria协同作用最明显,而Actinobacteria拮抗作用最明显。Latescibacteria、Actinobacteria、Chlorobi、FBP、Candidatus_Berkelbacteria、TM6、Parcubacteria、Acidobacteria和Peregrinibacteria九个门相关性较大,在整个菌群网络中起到了关键的作用。Latescibacteria和Actinobacteria是最关键的门,Latescibacteria、Chloroflexi、TM6、Peregrinibacteria、Acidobacteria和Peregrinibacteria与其他门均呈正相关；Actinobacteria、FBP、Cyanobacteria与其他门呈负相关,Actinobacteria是负相关最大的门。

图3 共线性网络和相关性网络分析图

2.4 土壤理化因子对根系土壤菌群的影响

不同样本的根系土壤理化因子见表3。通过VIF方差膨胀因子分析筛选发现OM、AK、AP、AN、pH和SM 6个土壤理化因子与根系土壤菌群结构显著相关,能够最大程度体现对根系土壤菌群的影响。

表3 冰川棘豆根系土壤基本理化因子分析

表中土壤理化数据为：平均值±标准偏差,“—”表示相关作用不显著的环境因子,VIF：方差膨胀因子

2.4.1典范对应分析

CCA分析结果表明(图4),第一排序轴(CCA1)解释度为19.61%,与有机物、pH、铵态氮、含水量、速效钾和速效磷的相关性系数分别为-0.77、0.54、-0.97、-0.84、0.97和-0.37；第二排序轴(CCA2)解释度为14.17%,与有机物、pH、铵态氮、含水量、速效钾和速效磷的相关性系数分别为-0.63、0.84、-0.25、-0.53、0.26和-0.93,两轴共同解释了物种构成变化的31.78%。根系土壤菌群丰度与有机物和pH极显著相关(P<0.01),与铵态氮、含水量和速效钾呈显著相关(P<0.05),与速效磷相关性不显著,有机物和pH是冰川棘豆根系土壤菌群丰度空间变异的最主要驱动因素。pH、有机物、速效钾、铵态氮、含水量和速效磷对群落物种分布的决定系数(R2值)分别为0.88、0.86、0.84、0.67、0.63和0.35。

图4 基于属水平的CCA分析

2.4.2土壤理化因子与菌群相关性Heatmap图

通过计算土壤理化因子与菌群之间的Spearman等级相关系数发现(图5),12个属丰度与土壤理化因子呈显著正相关,13个属丰度与土壤理化因子呈显著负相关,具体为：Nitrospira和KD4_96与铵态氮显著正相关,0319_6M6、Microvirga、Nocardioides和Methylobacterium与速效磷呈显著正相关,Gitt_GS_136和OM1_clade与速效磷呈显著负相关；Planctomycetaceae、Solirubrobacter、0319_6M6 、Planctomycetaceae和Solirubrobacterales与含水量呈显著正相关；Planctomycetaceae、Solirubrobacter和TK10与有机物呈显著正相关,Saccharibacteria与有机物呈显著负相关；Micrococcaceae与速效钾呈显著正相关,AKIW781、Nitrospira、JG30_KF_CM66 和Acidimicrobiaceae与速效钾呈显著负相关；Planctomycetaceae、Solirubrobacter、Gaiellales、Solirubrobacterales、0319-6M6和Ferruginibacter与pH呈显著负相关。

图5 土壤理化因子与菌群相关性Heatmap图

3 讨论

3.1 根系土壤细菌多样性指数

青藏高原高寒生态系统中植物根部土壤微生物菌群丰度与群落结构组成具有很大独特性[19],同一区域不同植被类型[20]或不同区域同一植被类型[21]的土壤微生物多样性具有一定差异,对青藏高原高寒生态系统气候变化的影响具有重要意义[22,23]。本研究发现,冰川棘豆根际土壤细菌群落多样性在不同生态环境下表现出一定特征,四种生态环境中菌群结构组成稳定在24个类群左右,而在菌群丰度上差异较大,高寒草原、高寒退化草原、高寒荒漠的菌群丰度高、差异小,高寒盐漠的菌群丰度与其他三种生态环境差异较大。形成这种特征的原因可能是由于四个样品采集点海拔在4287—5003 m之间,均属于极端环境,不同生态环境的冰川棘豆在长期适应下,其根系土壤细菌群落结构组成趋同且稳定,而菌群丰度随着植物根部代谢产物补给量和土壤理化因子的变化而变化。不同地区植物根部土壤微生物群落结构组成在门水平较为相似,在纲和属等分类级别下出现较大差异[24],本研究中,四个地区的生态环境特征及土壤理化性质有所差异,但在同一植物冰川棘豆根系土壤细菌主要类群上,体现出高度重叠,在门的层次相似度较高,物种进化方向保持相对一致,随着分类级别的提高,物种相似度降低,菌群属水平丰度有所变化,但优势菌群仍然表现出较大的相似度。

3.2 根系土壤细菌群落物种组成特征

植物会主动选择根部土壤的细菌群落的结构组成[25],抗逆性极强的多年生植物冰川棘豆根系可达到60—100 cm[9],发达的根系有益于在根系土壤中形成稳定的菌群结构[26]。变形杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和厚壁菌门等在冰川棘豆根系土壤中形成了优势类群。近年来,相关学者对水稻[27]、尼泊尔黄堇[28]、拟南芥[29]和玉米[30]等植物根部土壤细菌群落结构的研究发现,优势菌群分布在变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、酸杆菌门、浮霉菌门和芽单胞菌门等类群中,我们得到的结果与以上研究类似。冰川棘豆属于豆科植物,豆科植物根部土壤的氮素含量较高,所以根系土壤微生物数量也较多[31],包含有多种固氮菌的变形菌门在冰川棘豆根系土壤中丰度最高,可耐受干旱、低温等极端条件的厚壁菌门[32],在冰川棘豆根系土壤中丰度也较高。Aschenbrenner等根据微生物Nerwork共现性网络分析发现,地衣、苔藓[33]和树皮[34]的最核心菌群为Proteobacteria,我们利用该方法,成功构建了24个菌属组成的冰川棘豆根系土壤细菌核心菌群,核心菌群对保持菌群的多样性和稳定性、研究冰川棘豆在极端环境的适应性进化以及与其根系土壤微生物互作极其重要。Barberán等[35]通过相关性网络分析发现,某些与其他菌群关系密切种属在维持菌群结构与功能中最为关键,我们的研究发现核心菌群中发挥作用关键的菌属在不同的类群之间关系复杂,在极端环境下,植物根系土壤细菌群落更趋向于紧密的协同作用,因此菌群整体表现出协同作用大于拮抗作用的趋势。在Wang等[36]的研究中发现Arthrobactersp. HW08能够高效降解冰川棘豆苦马豆素,在本研究中Arthrobacter是冰川棘豆根系土壤细菌的主要核心菌群之一,并且在扎布耶盐湖地区的冰川棘豆根系土壤细菌中是丰度最高的菌属,这对揭示冰川棘豆根系微生物在极端环境下的适应性进化机制具有重要作用。

3.3 土壤理化因子对根系土壤菌群多样性的影响

土壤理化因子的差异使得不同区域的植物根部土壤微生物趋于多样性和差异分布[37],Mitter等[38]发现,不同地区的大麦和草木樨的根部土壤细菌群落组成存在明显的差异。本研究中,每个生态环境下的菌群聚在一起,羊八井、措勤和珠峰三地生态类型属于高寒草原退化过程中的不同阶段,故菌群相似度较高；扎布耶措属于高原盐漠,离散于其他生态类型之外,与其他生态类型的菌群差异较大。在我们研究中,不同的土壤理化因子对菌群相对丰度的正负相关影响不同,如在氮循环过程中的具有消化功能的硝化螺旋菌属Nitrospira[39]与铵态氮呈显著正相关；具有溶磷功能且与豆科植物根瘤形成相关的甲基杆菌属Methylobacterium[40]与速效磷呈显著正相关；具有厌氧氨氧化功能的浮霉菌Planctomycetaceae[41]与含水量呈显著正相关,可促进植物生根的壤红杆菌属Solirubrobacter[42]与含水量和有机物呈显著正相关；Planctomycetaceae、Solirubrobacter和Gaiellales等对pH变化敏感,与Sy等[43]的研究结果一致。有研究表明,植物根部土壤细菌群落结构组成与多样性主要受土壤pH和有机物的影响[44,45],本研究同样表明,在极端环境中pH和有机物对冰川棘豆根系土壤微生物菌群相对丰度影响最大。

4 结论

综上所述,不同生态环境中的冰川棘豆根系土壤细菌多样性丰富,保持了稳定的核心菌群,对冰川棘豆在高寒生态系统中形成优势种具有促进作用。菌群在适应极端环境的过程中,不同环境中的土壤理化因子会驱动菌群相对丰度发生变化,受土壤pH和有机物影响最大,从而使得菌群相对丰度在空间分布上产生差异。在下一步的研究中需要扩展研究尺度,检测土壤类型、粒度等更为全面的土壤理化性质和气候因子等数据,从多组学相互作用的层面分析冰川棘豆与其根系土壤微生物之间在功能上的关系,进一步了解根系土壤微生物对冰川棘豆在高寒生态系统中形成优势种的适应性进化机制,为青藏高原草地退化和荒漠化治理提供参考依据。