磺胺类抗生素分子印迹制备技术与应用进展

李心悦,张译丰,赖静娴,蔡湘萍,梁清文,赖 婷,徐振林,韦晓群

(广东省食品质量安全重点实验室,华南农业大学食品学院,广东广州 510640)

分子印迹技术(molecular imprinting technique,MIT)是指制备对某一特定的目标分子具有特异识别位点的聚合物的过程[1]。分子印迹聚合物(molecular imprinted polymer,MIP)的特别识别位点模仿了抗体或酶等生物体间的识别机制,模板分子与聚合物单体在合适的反应体系中混合后,功能单体与模板分子通过氢键、静电作用、疏水相互作用等分子间作用力形成结构互补的有序排列,通过交联剂使功能单体聚合,形成聚合物,最后从聚合物中除去模板分子可得到具有对模板分子有特异吸附键合位点的分子印迹聚合物[2-3]。MIP的高稳定性和对大多数目标分析物有效的通用性使它适用于众多成分的检测。

目前MIP已被广泛应用于食品中兽药残留的分析检测。已被作为模板分子研究的抗生素包括天然抗生素β-内酰胺类抗生素[4]、大环内酯类抗生素[5]、四环素族抗生素[6]等和合成抗生素喹诺酮类抗菌药物[7]、磺胺类抗生素[8]等,几乎涵盖所有养殖用药领域。磺胺类抗生素(sulfanilamide,SAs)作为一种与对氨苯甲酸(p-aminobenzoic acid,PBPA)结构类似[9]的抗生素,具有抗菌谱系广、价格便宜[10]的特点,被作为兽药广泛应用于预防和治疗细菌和病毒引起的动物疾病和原生动物感染疾病[11]。欧洲是磺胺类药物使用最为广泛的地区之一,每年在猪的饲养中使用的磺胺噻唑就高达400000 kg,磺胺二甲嘧啶的使用量也高达350000 kg[12]。由于磺胺类药物被频繁使用甚至违规滥用,它已成为目前最常被检出的抗菌类药物之一。为解决磺胺类抗生素滥用的问题,动物性食品中的磺胺类药物的最大残留量(maximum residue limit,MRL)被规定为100 μg·kg-1[13]。为了实现磺胺类药物检测标准化,我国制定高效液相色谱法[14]的国家标准(GB 29694-2013),这一检测方法准确性高,但是前处理步骤复杂,使用具有特异性的MIP作固相萃取材料可有效简化样品前处理步骤,Rozaini等[8]使用分子印迹薄膜,实现了对水样中SAs的直接检测,同时,MIP处理后的样品还存在富集率高、选择性好等优点,有效地降低了样品中复杂基质对待测物检测结果的干扰,在Xu等[15]的研究中,使用MIP后,猪肉等肉类样品的检测限达0.20～0.72 μg/kg,仪器检测精度高。因此,MIP在磺胺类药物的检测中具有重要的应用价值。

本综述对各磺胺类抗生素分子印迹聚合物的制备条件进行了收集和汇总,分析在不同优化条件下分子印迹聚合物的结构和性能差异,总结了其在各样品检测中的多种应用模式,并对其优缺点及发展前景进行综述。

1 磺胺类药物分子印迹聚合物的反应体系研究现状

1.1 模板和功能单体的选择

磺胺类抗生素由对氨基苯磺酰胺和取代了磺酰胺基上一个氢的杂环基团(用R指代)两部分组成[16],可作用位点如图1所示,包括可与功能单体形成氢键作用力的氨基和硫氧键,以及能与部分功能单体或交联剂形成疏水作用力和п-п相互作用力的苯环。

图1 磺胺类药物的结构图Fig.1 Structure of sulfonamides

磺胺类抗生素的结构特点决定了它的分子印迹聚合方法多属于非共价型聚合,这一聚合方法的分子间相互作用力弱,要求模板分子的功能位点个数适中,在模板与功能单体间有足够作用强度的同时,避免模板分子与功能单体的结合过于牢固而导致的模板分子难以从MIP中除去的情况。除此之外,分子印迹还要求模板分子具有较高的溶解性。磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)[17-20]、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine,SMZ)[15,21-22]、磺胺二甲氧基嘧啶(sulfamethazine,SDM)[23-24]同属磺胺嘧啶类抗菌剂,三种化合物结构相似,溶解性较好,R基团嘧啶环上的两个胺基可提供两个氢键结合位点,可辅助磺胺基上的四个氢键结合位点形成稳定的非共价型络合结构,有利于MIP特异性空腔的形成,因此,如图2所示,拥有嘧啶杂环的磺胺类抗生素作为模板分子的频率,达57%,即一半的磺胺类抗生素分子印迹的模板分子都属于磺胺嘧啶类。一方面,这是因为其化学性质的适配性,另一方面,这是由市场应用情况决定的,SD、SMZ和SDM作为中效抗菌剂,使用范围广泛,残留情况相对严重[12],用它们制备的MIP具有更高的实用性。磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole,SMO)[25]作为磺胺类抗生素中的常用药,同样存在较严重的药物污染问题,而且其噁唑杂环也可为MIP提供两个氢键结合位点,是较为理想的模板分子材料,因此,磺胺甲噁唑也常被用作MIP的模板分子,其占比高达19%。

图2 磺胺类分子印迹模板分子使用情况Fig.2 Usage of template moleculein sulfonamide molecularly imprinted注：该图以JCR I、II区文献为主要统计数据,2002～2018年。

功能单体与模板分子在有机介质中识别程度的差异也是选择模板分子的影响因素之一[24],由于功能单体的pH、极性、结构等存在差异,不同的磺胺类模板分子与功能单体间的络合效果也有所不同。在已有的报道中,甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)的使用频率最高,这可能与磺胺二甲基嘧啶被作为磺胺类抗生素分子印迹的常用模板分子有关。对比表1 MIP-1和MIP-2发现,当SMZ和MAA分别作为模板分子和功能单体时,MIP的选择性显著。Isarankura-Na-Ayudhya等[26]使用计算机模拟技术,对这一现象进行分析,发现MAA与磺酰胺部分的结合能达-91.9364 kJ/mol,比1-乙烯基咪唑与磺酰胺部分的结合能高一倍,而当功能单体与模板分子间能量较高时,MIP的结合位点亲和力更高[27]。由于磺胺类抗生素分子印迹选用的模板结构多与SMZ类似,所以MAA功能单体在磺胺类分子印迹中普遍适用。但是,MAA作为一种可同时成为氢键供体和受体的功能单体,MAA和MAA之间的结合能很高[26],当模板分子与MAA间的结合能不足时,MAA容易自聚,MIP效果反而不理想。表1 MIP-5显示,当SMO作为模板分子时,功能单体MAA并不能为MIP带来较好的特异性。除此之外,将表1 MIP-1、MIP-2和MIP-3的实验结果进行对比,还可以发现,功能单体的复合使用对MIP的吸附性能和选择性有了很大提升[28-29],乙烯基功能单体的复合使用为磺胺类分子印迹的优化提供了更多可能。

表1 模板分子和功能单体对分子印迹聚合物特异性的影响Table 1 Effects of template molecules and functional monomers on the selectivity of molecularly imprinted polymers

近年来,为解决乙烯基功能单体聚合的MIP易受强极性溶剂干扰的问题,部分报道提出了选用非乙烯基功能单体的研究思路。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTEs)[18]、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(KH570)[22]等需要使用溶胶-凝胶法聚合的硅烷偶联剂功能单体,还有三聚氰胺和间苯二酚[30]等的水溶性亲水性功能单体都属于新型非乙烯基功能单体。这一类型的功能单体区别于MAA、4-VP等传统乙烯基功能单体,拥有较多的羟基和可在水相环境下聚合的能力,可有效抑制强极性环境对自身的干扰。除此之外,拥有特殊性质的功能单体还可以赋予MIP特殊的控制性性能。Chen 等[17]利用4-[(4-甲基丙烯酰氧基)苯基偶氮]苯磺酸(4-[(4-methacryloyloxy)phenylazo]benzenesulfonic acid,MAPASA)中的偶氮苯留色子可在指定光波长下发生异构化的特点,通过光波长的变化改变其识别位点的空间排列,使得MIP具有控制模板分子结合和释放的能力,设计出了以它作为功能单体的光敏分子印迹聚合物。功能单体种类选择和创新应用是分子印迹制备中的一个重要课题。

1.2 交联剂的选择

交联剂的作用是固定模板分子周围的功能单体及其官能团,从而形成高度交联的刚性聚合物。交联剂的使用量对于分子印迹聚合物的结合能力和构型都有着显着的影响,过低易造成聚合物的结构坍塌,过高则不利于具有选择性空腔的形成[31]。在磺胺类药物的乙烯基聚合过程中,最常用的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA),其他交联剂如N,N-二甲基甲酰胺[32]和二乙烯基苯(divinylbenzene,DVB)[24]则只在部分文献中出现。最新研究中开发的溶胶-凝胶聚合法,如表2[8,18,33]所示,主要使用正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate,TEOS)作交联剂,通过掺杂荧光量子点,利用荧光信号强度对SAs进行定性定量检测。因为TEOS聚合条件为常温、碱性,而SAs在低温碱性条件下性质稳定,所以区别于乙烯基60 ℃的聚合条件[28-29],TEOS作交联剂能有效防止SAs在MIP聚合过程中分解的情况,为MIP形成稳定印迹位点提供保障,除此之外,二氧化硅表面含有丰富的羟基[34],可为SAs提供除功能单体外的作用基团,强化印迹效果。

1.3 致孔剂的选择

致孔剂的物理和化学特性对模板分子和功能单体的预聚合具有显著影响力,是决定分子印迹聚合物能够有效分子识别的最重要的因素之一。对于非共价型分子印迹,水相的溶剂聚合环境会降低分子印迹的吸附效果[24],因此非共价型磺胺类分子印迹制备时,多选用非中等极性或非质子溶剂,如甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙腈等,避免干扰模板分子和功能单体间的络合作用。

目前,非共价型磺胺类分子印迹的制备多使用乙腈[8,23,33]作为致孔剂,但嵇大圣[35]通过Tomasi极化统一模型(polarized continuum mode,PCM)模拟计算发现,MAA和磺胺在乙腈中的溶剂化能比在氯仿、苯和丙酮中大,即高介电常数的乙睛溶剂不利于磺胺模板与MAA之间相互络合。部分研究就该问题开始探索新型溶剂,如异辛烷[32]等。Guo等[36]以四氢呋喃作溶剂制得检测限为1 ng/g,定量限为3.5 ng/g的分子印迹聚合物,证明了在分子印迹聚合物的致孔剂、溶剂的种类选择上具有广阔的研究空间。

2 磺胺类药物分子印迹聚合物合成方法的研究现状

分子印迹制备方法包括:本体聚合法、原位聚合法、沉淀聚合法、分散聚合法、二维分子印迹技术和表面分子印迹技术[37]。最常用于磺胺分子印迹的方法分别是本体聚合法和表面印迹法,但因为本体聚合法拥有作用位点易包埋、成品处理困难等缺陷,仅适用于基础研究[28-29],所以创新应用型的研究倾向于使用表面印迹法。

表面分子印迹技术是通过接枝、化学改性、涂覆等方法使印迹识别点分布在基体表面的一项技术,解决了传统方法包埋识别位点造成应用效率不高的问题。表面分子印迹的制备过程可分为三部分,分别是基体、基体表面改性以及印迹。基体的选择与分子印迹的用途相关,目前常用于磺胺表面分子印迹的基体包括:硅胶或二氧化硅[38-40]、磁珠[41-42]以及其他基体(如:电极[43-44]和高聚物[24,45]等),具体使用情况如表2所示。

表2 磺胺类药物分子印迹聚合物的研究现状Table 2 Research status of sulfonamide molecularly imprinted polymers

2.1 硅胶表面分子印迹

硅胶作为基体的分子印迹聚合物可作为色谱柱填料应用于固相萃取、色谱分离、吸附剂等多个前处理领域。目前,以硅胶为基体的表面分子印迹是研究重点,共分为两类,分别是:

2.1.1 传统二氧化硅基体分子印迹 对纳米二氧化硅颗粒、二氧化硅毛细管柱等传统的二氧化硅产品[15,21]进行表面分子印迹改性,可有效增大分子印迹的比表面积,有效提高印迹作用位点的吸附效率和利用率。纳米二氧化硅颗粒被硅烷偶联剂进行表面改性,制备出一种包裹着一层印迹胶束结构的球形二氧化硅纳米颗粒[15],受基体形貌限制,成品仅作为SPE填料使用,但基体改性方式多,如:具有选择性的新型限制性存取分子印迹材料(Restricted access-molecularly imprinted material,RA-MIP)[40]。二氧化硅毛细管柱则可被印迹层涂覆覆盖,作为选择性的萃取搅拌棒使用,有效增加了印迹的应用途径。这一类型的印迹有较高的吸附效率和利用率,但本质还是乙烯基聚合的分子印迹聚合物,易受水的影响,需在有机溶剂环境中使用。

2.1.2 新型二氧化硅分子印迹 溶胶-凝胶法在含水介质中合成分子印迹二氧化硅(molecularly imprinted silica,MIS)。这类聚合物受水等强极性溶剂的影响较小,一定程度上保留了应用于模板分子和功能单体在强极性溶剂环境下的络合能力。Ding等[18]将MIS与表面印迹有机结合,先让TEOS在水中进行初步聚合,形成掺杂荧光量子点的核壳结构,随后加入模板分子SD、功能单体APTEs形成印迹层,得到掺杂荧光量子点的MIS。由于MIS在聚合阶段是在水中进行的,因此使用MIS萃取水性样品时,模板SD的IF值远高于另外5种磺胺类药物,特异性显著。除此之外,MIS还衍生出了凝胶薄膜的状态[8],该产品在针对水性样品进行检测时,检测限低至0.06 μg/L,灵敏度优于大部分商用免疫检测产品[46],这一发现,使分子印迹聚合物有望成为独立的产品,对分子印迹应用领域的进一步扩展起到了积极的作用。

2.2 以磁性颗粒为基体的表面分子印迹

磁性颗粒表面分子印迹聚合物是一种以磁珠为核心,油酸[42]或二氧化硅为连接层,分子印迹为外壳的核壳结构[47]聚合物。这个基体的制作流程则与传统表面印迹方法类似,但需要注意的是,因为磁珠不能与印迹层直接连接,所以磁性颗粒表面分子印迹不能如硅胶般根据使用需求进行形貌结构调整。磁性颗粒作基体的分子印迹聚合物体积普遍较小,Zhao等[48]延用了他在制备2,2-双(4-羟基苯基)丙烷印迹聚合物时的方法,制备出内径70 nm、外径150 nm的核-壳纳米氨基官能化磁性印迹聚合物(CS-NR-Mag-MIP)[43],检测限低至0.004 μg/L。这个表面印迹方法在保留了二氧化硅表面印迹的比表面积大的优势的同时,可利用磁性实现MIP与样品的快速分离,具有使用步骤少,操作方便的优点。崔一笑[49]利用磁性颗粒MIP可在外加磁场的作用下集中吸附于一处的特点,简化固相萃取步骤,利用磁性基质固相萃取方法分别对鸡肉、牛奶、羊奶样品进行检测,回收率分别为82.27%～120.93%、78.67%～98.90%、62.66%～94.73%,回收效果较好,但是通过表2发现,与其他基体的MIP相比,这类型的分子印迹聚合物回收率效果中等,部分成品存在检测限高的问题[42],这可能是因为磁珠间存在磁性吸附关系,导致磁性MIP易发生团聚,磁性MIP的印迹层利用率相对下降。

2.3 以其他物质为基体的表面分子印迹

通过使用分子印迹对化学传感器的电极进行改造,可使电化学传感器有选择的对样品中的目标物质进行定量检测,实现电化学传感器检测的定性定量分析。在电极表面进行印迹需要将MIP用低沸点的溶剂分散在电极表面,经过干燥、抛光、水洗等步骤[44],在溶剂挥发后电极表面形成一层印迹薄膜,即可得到改性电极,通过研究,已出现了改性碳糊电极(carbon paste electrode,CPE)、石墨烯氧化物(graphene oxide,GO)改性的玻碳电极(glassy carbon electrode,GCE)[50]、改性的表面声波(surface acoustic wave,SAW)芯片的金电极[45]等,这些电极与电化学传感器结合使用,能有效抑制样品中杂质对检测结果的干扰、检测结果稳定、重现性好、灵敏度高。

至于以聚合物为基体的分子印迹聚合物,主要能起到增大印迹应用面积,拓宽印迹使用途径的目的。Chen等[45]和Diaz-Alvarez等[24]分别尝试了聚苯乙烯种子微球和聚丙烯中空纤维作基体,制备出的聚合物通过对不同组分的提取效率差异,有效分离样品中的各磺胺类抗生素,但如表2所示,该类聚合物的检测限仅有0.2～3 μg/L[24]，略逊色于另外几种基体。

3 磺胺类药物分子印迹聚合物在样品分析中的应用

自从Sellergren使用MIP从尿液样品中萃取出潘他米丁[8],MIP作为固相萃取材料得到了广泛而深入的研究,随着市场对快速检测产品的需求增加,磺胺类抗生素分子印迹的应用正逐渐简化,朝快速检测产品方向转变。

3.1 作为固相萃取柱的应用

磺胺类药物作为水产品养殖业、畜牧业中的抗菌剂使用,多出现在畜牧类产品中,部分药物通过养殖用水流入环境,因此,该药物的检测样品集中在环境样品和食品样品中。

MIP作为固相萃取材料应用在禽畜类产品中时,步骤最复杂。禽畜类产品包括牛奶[51-52]、鸡蛋[53]、肉[54]等,富含蛋白质、脂质和纤维等大分子,在使用MIP富集前,一般需进行初提取以排除样品中的大分子对MIP的干扰。牛奶可用少量乙酸铅溶液沉淀并除去蛋白质[51],禽畜肉类则需要经历均化、吸水、多种溶剂反复提取、蒸发复溶等一系列步骤[55]。这一类样品的初提取普遍用时长、步骤复杂,萃取效率受待测物在提取剂中的溶解度等因素影响。若MIP能排除大分子干扰,使禽畜类样品无需经过复杂的初提取步骤即可直接应用,可有效简化MIP使用程序,提高MIP使用效率。

水产品样品和土壤样品同样需要进行初提取后才能被MIP富集目标成分,但相比禽畜类产品的初提取步骤,水产品样品和土壤样品的初提取步骤更简单,只需要使用能快速提取目标分子的有机溶剂提取即可[56]。唯一的难点主要集中在水产品样品中含水量较高,易出现MIP特异性降低的现象,这个缺陷可通过把MIP制作成固相萃取柱,通过调整洗涤溶剂的极性和流速,实现样品中各组分的有效分离[57-58]。Shi等[23]制备的MIP静态吸附时选择性较差,但正是利用了各组分在相同溶剂环境下与功能基团作用力的差异,有效分离了样品中的各磺胺类药物。方法利用了洗涤溶剂在固相萃取过程中,能在破坏分析物与功能基团间相互作用力的同时,保留目标待测物和印迹位点的键合能力[59-60]的特点,目标分子及其结构类似物在MIP固相萃取柱中拥有比其他结构更慢的洗脱速度,从而有效区分目标分子及其他组分,同样适用于水性样品的直接应用。

3.2 在水性样品中的直接应用

理论上,MIP固相萃取柱可以让实际含水样品无需经过有机溶剂的提取直接使用,但是真实水样中存在多种杂质,如酸或者盐等,都会对MIP的选择性进行破坏,降低回收率[61]。对于这类杂质,可以调节水性样品的pH或者让水性样品先通过常规吸附剂(如C18,DVD)进行初步除杂,之后MIP固相萃取柱对各成分进行吸附提取,并和水产品样品一样,选用一种不会破坏MIP各功能位点和待测目标物的洗涤剂,诱导空腔对目标分析物进行选择性保留,最后收集MIP中的目标检测物,实现对样品中各组分有效分离[62-64]。一般在检测磺胺类药物的时候,选用甲醇水溶液作洗涤剂除去杂质[65],甲醇的比例随MIP保留能力强度的加强而加强。乙酸∶甲醇(5∶95,v/v)作为洗脱剂萃取,该比例下的甲醇溶液能最大程度上回收MIP中的磺胺类药物[66]。

图3 手性向列型印迹复合膜的制备和应用流程Fig.3 Preparation and application process of chiral nematic imprinted composite membrane

随着MIS的发展与应用,分子印迹逐渐摆脱传统乙烯基聚合法易受水影响导致特异性下降的限制。制备溶剂为水的MIS受水强极性影响较小,掺杂荧光量子点后与荧光检测器联合使用,可在提高灵敏度的同时减小样品的除杂步骤,部分报道中,水性样品只需要经过简单的过滤步骤即可直接使用MIS萃取目标物质[18,33]。MIS的出现进一步简化了分子印迹的使用流程,提高了分子印迹聚合物成为一种针对水性样品的独立快检产品的潜力。

3.3 作为快检方法的应用研究

分子印迹技术的基本原理是模仿免疫抗原抗体相结合的特性衍生出的仿生技术,MIS[18,33]和电极[44-45]为基体的分子印迹聚合物一定程度上可作为一种快检产品直接使用,但由于吸附现象不显色、现象不明显等缺陷,需要依附检测仪器使用,无法像免疫抗原抗体法一样制备出胶体金一类的快速检测用的试纸条,不利于推广。部分研究为解决磺胺类药物分子印迹聚合物的应用问题进行探索。Zhang等[67]基于纳米晶体纤维素模板化的分子印迹树脂制造光学磺酰胺传感器技术,合成了手性向列型印迹复合膜,该薄膜通过手性向列结构中重新印刷的印迹位点,对磺胺类药物产生黄色变化反应,观察该薄膜的颜色反应后,可直接选择出磺胺类药物(图3)。手性向列型印迹复合膜对磺酰胺有选择性,与免疫抗原抗体法中的试纸条效果相似,有广泛推广使用的潜力,但其检测限范围高达0.05～10 mg/mL,灵敏度不如仪器分析法,若能有效提高该技术的灵敏度,磺胺类抗生素分子印迹快速检测技术将有望实现进一步的推广和应用。

4 结语

分子印迹聚合物的稳定性、制作周期短、低成本和特异选择性使其能在一定程度上替代酶联免疫技术,目前,分子印迹聚合物用于磺胺类药物的分析检测已被大量报道。磺胺类抗生素分子印迹的优化可通过分析模板分子和功能单体间的非共价作用力,选用作用位点适中、易形成稳定空腔结构的模板分子、功能单体和交联剂,实现分子印迹聚合物性能的优化。

磺胺类抗生素分子印迹还可以通过调整制备工艺进行优化。制备工艺和应用模式存在联系,传统的制备工艺,如本体聚合物法，以二氧化硅、磁珠、高聚物等作为基体的表面分子印迹聚合法等制备的MIP多作为固相萃取材料,应用于常规肉类食品之中,这部分的技术最为成熟,部分技术已转化为产品投入市场,如:MIP Technologies(瑞典Lund)和Semorex(North Brunswick,NJ,USA)[68]等。溶胶-凝胶法制备的MIS则是分子印迹技术在水性样品中使用的主要趋势,虽然在大多数情况下,目标分子在水性介质中的直接选择性结合仍然是困难的案例,但具有成为快速检测单一产品的潜力。此外,基于纳米晶体纤维素模板化的分子印迹树脂制造光学磺酰胺传感器技术合成的手性向列型印迹复合膜,使分子印迹技术能以试纸条的形式应用于实际样品,有望实现磺胺类分子印迹技术的商业化,但目前该技术仍有改进空间。