两种方法提取佛手渣多糖及其对巨噬细胞RAW264.7免疫调节活性的研究

,3,*,3

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;2.广东展翠食品股份有限公司,广东潮州 515634;3.广东省功能食品活性物重点实验室,广东广州 510642)

佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle)为芸香科香橼属植物佛手的果实,又名佛手柑、香橼、蜜罗柑、福寿橘,具有疏肝理气、和胃止痛、生津化痰的功效,可治疗肝胃气滞、胸闷胀痛、食少呕吐、咳嗽痰多等症,是我国名贵的传统中药材[1]。佛手含有挥发油、香豆素、黄酮、氨基酸、矿物质和多糖等多种活性成分,随着佛手化学成分、药理作用等研究的不断深入,其抗癌、抗氧化、免疫调节等作用也逐渐被大众熟知[2-3]。据文献报道,佛手含有总糖8. 01%[4],而广佛手的多糖含量平均为5.56%[5]。目前关于佛手多糖的提取方法有热水提取法[6-12]、碱提法[13]、超声辅助提取法[14]、复合酶提取法[15]等,这些方法都存在耗时长、溶剂消耗大、操作不便等缺点,不适合大规模工业化连续性生产。连续相变萃取法(Continuous phase-transition extraction,CPE)是本课题组自主研发的一种新型高效萃取方法[16]。它是在超临界、亚临界萃取技术的基础上,在密闭环境中控制压力对物料进行连续的逆流萃取,无溶剂残留,溶剂重复回收率高,无需过滤即可分离浆渣,且在密闭系统进行萃取,不会造成环境污染[17-18]。目前CPE法已广泛应用于提取油脂类物质[17-21]和膳食纤维[22],而用于提取多糖则尚未见报道。

近年来,植物多糖的研究备受关注,大量研究结果表明植物多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7具有良好的免疫调节作用[23-28]。巨噬细胞是天然免疫系统中最重要的免疫细胞之一,是衰老细胞、病原体和癌细胞的第一效应细胞,其活化被认为是免疫系统刺激的主要和必要步骤[29]。巨噬细胞表面具有多种受体,与植物多糖结合后可转变为活化的巨噬细胞,产生如一氧化氮(nitticoxide,NO)等活性细胞因子,参与细胞内炎症反应过程,清除相关病原体,从而发挥免疫调节作用[30]。但目前关于佛手多糖免疫活性的研究鲜见报道。基于上述分析,本文以CPE法提取精油和黄酮后的佛手渣作为原料,分别采用CPE法和热水浸提法(Hot water extraction,HWE)提取佛手多糖,比较两种提取方法的得率和提取率;并以RAW264.7巨噬细胞为模型,初步探究由两种方法提取并经醇沉和脱除蛋白质的佛手多糖的体外免疫活性,为佛手资源的综合开发利用及佛手多糖产品研发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

广佛手干片 广东展翠食品股份有限公司提供;小鼠腹腔RAW264.7巨噬细胞 中国科学院干细胞库提供;DMEM高糖培养基 赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;PBS缓冲液(pH7.4) 赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司;四季青胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;青-链霉素溶液 美国Gibco公司;噻唑蓝(MTT)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS) 美国Sigma公司;中性红 美仑生物;NO试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司;其它试剂均为市售分析纯。

连续相变萃取装置 本课题组自主研发;BJ-400A中草药万能粉碎机 浙江温岭市药材机械厂;DF-101S型数显电热恒温水浴锅 巩义予华仪器有限公司;UV-3010型紫外分光光度计 日本日立高科技公司;AL104型万分之一电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Enspire 2003型多功能酶标仪 美国PerkinElmer公司;BDS 200倒置生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限责任公司;CCL-170B-8 CO2培养箱 新加坡艺思高(ESCO)科技有限公司;Airstream® A2型二级生物安全柜 新加坡艺思高(ESCO)科技有限公司。

图1 连续相变萃取装置构造示意图Fig.1 Structure diagram of continuousphase-transition extraction device注：S1:过滤器；S2：高压泵；S3：流量计；S4：真空泵；S5：乙醇；S6：丁烷；Vi(i=1,2,3 to 9):阀门；Pi(i=1,2,3 to 6):压力表；K1、K3：热交换器；K2：萃取釜；K4、K8：解析釜；K5、K9：蒸馏塔；K6、K10：冷凝器；K7、K11：蓄液罐。

1.2 实验方法

1.2.1 佛手干片预处理 将广佛手干片粉碎后过30目筛,经过CPE法依次提取佛手精油[31]和黄酮后[32],得到的佛手渣在55 ℃烘箱进行干燥,储藏于4 ℃,备用。

1.2.2 提取流程

1.2.2.1 CPE法 称取一定量的佛手渣于萃取釜中,以蒸馏水为溶剂,在0.2～0.4 MPa压力下,设置萃取温度为80～100 ℃,萃取流速50～70 L/h,连续萃取3.0～5.0 h,萃取得到的佛手多糖提取液进入解析釜中,解析温度与萃取温度一致,通过加热减压使萃取剂相变为气体,再通过及时压缩变为液体储存在溶剂罐中,溶剂通过管道流回萃取釜,对物料再次进行加压萃取,如此往复循环,无需过滤即可实现浆渣分离得到佛手多糖粗提液。

1.2.2.2 HWE法 称取一定量的佛手渣于烧杯中,以蒸馏水为溶剂,设置萃取温度为85～95 ℃,液料比为50～70 mL/g,连续萃取2.0～3.0 h,过滤收集上清液,向滤渣加入相同比例的溶剂再次萃取相同时间,过滤后合并两次滤液即得佛手多糖粗提液。

1.2.3 响应面优化佛手多糖提取工艺 根据前期的单因素实验结果,在0.2～0.4 MPa压力下,选择A温度(℃)、B时间(h)、C流速(L/h)三个因素为CPE法的自变量,选择A温度(℃)、B时间(h)、C液料比(mL/g)三个因素为HWE法的自变量,以佛手多糖提取率为响应值,采用Box-Behnken中心组合设计进行响应面优化。各因素的编码值与真实值见表1。

表1 Box-Benhnken设计试验因素水平表Table 1 Factor and level of Box-benhnken design test

1.2.4 佛手多糖纯化 将得到的佛手多糖粗提液浓缩至原体积的1/8,加入四倍体积的无水乙醇,在4 ℃条件下静置沉淀24 h,过滤后脱水干燥得到醇沉多糖,再采用Sevag法[33]脱除醇沉多糖中的蛋白质,冷冻干燥即得到佛手多糖(CPE法提取的醇沉多糖CCP、脱蛋白多糖CDP和HWE法提取的醇沉多糖HCP、脱蛋白多糖HDP)。参照He等[34]的方法,以葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸法测定佛手多糖含量,根据线性回归方程计算佛手多糖提取率,根据冻干后的样品质量计算得率:

佛手多糖提取率(%)=C×F×V/M×100

式(1)

佛手多糖得率(%)=m/M×100

式(2)

式中(1)、(2)中:C为佛手多糖溶液质量浓度,g/mL;F表示佛手多糖溶液稀释倍数;V表示佛手多糖溶液体积,mL;M表示佛手渣质量,g;m表示冻干后得到的佛手多糖质量,g。

1.2.5 佛手多糖对巨噬细胞RAW264.7的免疫调节作用

1.2.5.1 MTT法检测巨噬细胞的增殖作用 取对数生长期的RAW264.7细胞,调整细胞浓度为1×105个/mL,按照每孔200 μL加入96孔细胞培养板中,在37 ℃,5% CO2条件下培养24 h。弃去培养基,分别加入200 μL含有不同浓度(10、25、50、100、250、500、800、1000 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培养基,每组设置6个复孔。培养24 h后,弃去上清液,每孔加入50 μL 1 mg/mL的MTT溶液,于37 ℃继续培养4 h,弃去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液,震荡混匀后测定490 nm处吸光值A。细胞增殖率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100。

1.2.5.2 佛手多糖对巨噬细胞NO分泌的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞,按4×104个/孔加入96孔细胞培养板中培养24 h,每孔200 μL。分别加入200 μL含有不同浓度(5、10、25、50、100、200、250、500 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培养基,空白对照和阳性对照组分别加入等体积的DMEM完全培养基和2 μg/mL LPS,每组设置6个复孔,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h 后取50 μL细胞培养上清液,与等体积的Griess试剂混合,避光反应10 min,在酶标仪上测定540 nm处吸收值,并根据标准曲线计算NO分泌量。

1.2.5.3 中性红实验检测巨噬细胞吞噬活性 取对数生长期的RAW264.7细胞,按4×104个/孔加入96孔细胞培养板中培养24 h,每孔200 μL。弃去上清液,分别加入200 μL含有不同浓度(5、10、25、50、100、200、250、500 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培养基,空白对照和阳性对照组分别加入等体积的DMEM完全培养基和2 μg/mL LPS,每组设置6个复孔,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后弃去上清液,各孔分别加入50 μL含有0.05%中性红PBS溶液,继续培养4 h。弃去上清液,用PBS洗3遍,每孔加入细胞裂解液(乙醇∶冰醋酸=1∶1)100 μL,室温下放置2 h,待细胞溶解后,在酶标仪上测定540 nm处吸光值A。细胞吞噬率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100。

1.3 数据处理与分析

所有实验均重复3次,实验数据以均值±标准差来表示;采用SPSS 17.0进行单因素方差分析,利用Origin 9.0和Design-Expert 8.0.6软件分别对实验结果进行作图与响应面分析。

2 结果与分析

2.1 CPE法提取佛手多糖响应面工艺优化

2.1.1 CPE法回归模型的建立与方差分析 根据单因素实验结果,以佛手多糖提取率(Y)为响应值,将温度、时间和流速三个因素进行Box-Behnken中心组合设计响应面优化,其结果见表2所示。

表2 CPE法Box-Benhnken试验设计及结果Table 2 Box-Benhnken experimental design arrangementand experimental results of CPE method

试验结果采用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对表2中17个试验点的响应值进行多元回归拟合得到佛手多糖提取率与温度(A)、时间(B)和流速(C)各因素的二次多项回归方程模型Y1:

Y1=14.74+2.54A+0.49B+0.11C-0.13AB+0.96AC+0.57BC-1.77A2-0.72B2-1.00C2对模型进行显著性检验,由回归模型的方差分析表3可以看出,CPE法提取佛手多糖的提取率整体模型的F为9.43(P<0.01),因此,模型因子具有极显著性意义。该模型的失拟项F为6.19(P>0.05),无显著性差异,说明这种试验方法是可靠的,模型能够很好的推测试验结果。表3中,CPE法提取佛手多糖的提取率模型决定系数R2为0.9238,说明该模型拟合程度良好,试验误差小;校正拟合度R2Adj为0.8258,说明模型可以解释82.58%响应值的变化。变异系数CV为7.42%,CV反映模型的置信度,CV值越低,模型的置信度越高[35]。信噪比(Adeq Precision)为9.379,信噪比大于4为理想值,说明模型有着较好的信噪比,试验稳定性比较高,模型方程能够较好地反映真实的试验值[36]。因此,可以用该回归方程模型来解释CPE法提取佛手多糖设计方案。

表3 CPE法回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of CPE method

表3中F值越大表明该因素对佛手多糖提取率影响越显著,各因素对多糖提取率的影响大小依次为:温度(A)>时间(B)>流速(C)。在此模型中A和A2是极显著性因子项(P<0.01),而B、C、AB、AC、BC、B2、C2无显著性差异(P>0.05),说明提取温度、时间、流速两两间交互作用不显著。

2.1.2 CPE法最佳工艺条件的确定及验证试验 通过Design-Expert 8.0.6软件求解方程,系统预测得出CPE法提取佛手多糖的最佳工艺条件为:温度98.62 ℃,时间4.5 h,流速66.09 L/h,模型预测的佛手多糖提取率为15.99%。考虑到实际操作因素,将上述优化条件修正为:温度99 ℃,时间4.5 h,流速66 L/h。经过试验验证得出,在此条件下佛手多糖的提取率为16.09%,与模型预测值仅相差0.10%。因此,响应面法优化CPE法提取佛手多糖是可行的,得到的多糖提取条件具有实际应用价值。

2.2 HWE法提取佛手多糖响应面工艺优化

2.2.1 HWE法回归模型的建立与方差分析 根据单因素实验结果,以佛手多糖提取率(Y)为响应值,将提取温度、时间和液料比三个因素进行Box-Behnken中心组合设计响应面优化,其结果见表4所示。

表4 HWE法Box-Benhnken试验设计及结果Table 4 Box-Benhnken experimental design arrangementand experimental results of HWE method

试验结果采用Design-Expert.V 8.0.6.1软件对表4中17个试验点的响应值进行多元回归拟合得到佛手多糖提取率与提取温度(A)、时间(B)和液料比(C)各因素的二次多项回归方程模型Y2:

Y2=12.75+1.65A+0.94B-0.028C+0.14AB-0.022AC+0.088BC-0.25A2+0.37B2-0.097C2

对模型进行显著性检验,由回归模型的方差分析表5可以看出,HWE法提取佛手多糖的提取率整体模型的F为14.50(P<0.01),因此,模型因子具有极显著性意义。该模型的失拟项F为2.79(P>0.05),无显著性差异,说明这种试验方法是可靠的,模型能够很好的推测试验结果。佛手多糖提取率模型的决定系数R2为0.9491,说明该模型拟合程度良好,试验误差小;校正拟合度R2Adj为0.8836,说明模型可以解释88.36%响应值的变化。变异系数CV为3.75%,说明模型有着较高的置信度,表明该实验具有很高的精确度和良好的可靠性。信噪比(Adeq Precision)为14.120,说明实验稳定性高,模型方程可以很好反映试验值的真实性。因此,可以用该回归方程模型来解释HWE法提取佛手多糖设计方案。

表5 HWE法回归方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation of HWE method

由表5分析结果可知,各因素对多糖提取率的影响大小依次为:温度(A)>时间(B)>液料比(C)。在此模型中A和B是极显著性因子项(P<0.01),而C、AB、AC、BC、A2、B2、C2无显著性差异(P>0.05),说明提取温度、提取时间、液料比两两间交互作用不显著。

2.2.2 HWE法最佳工艺条件的确定及验证试验 通过Design-Expert 8.0.6软件求解方程,系统预测得出HWE法提取佛手多糖的最佳工艺条件为:温度95 ℃,时间3.0 h,液料比63.20 mL/g,提取2次，模型预测的佛手多糖提取率为15.62%。考虑到实际操作因素,将上述优化条件修正为:温度95 ℃,时间3.0 h,液料比63 mL/g，提取2次。经过试验验证得出,在此条件下佛手多糖的提取率为15.43%,与模型预测值仅相差0.19%。因此,响应面法优化HWE法提取佛手多糖是可行的,得到的多糖提取条件具有实际应用价值。

2.3 两种提取方法比较

图2 佛手多糖对RAW264.7细胞增殖的影响Fig.2 The effect of bergamot polysaccharide on the proliferation of RAW264.7 cells注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05),图3、图4同。

从表6可知,CPE法在0.20～0.4 MPa的压力下对佛手多糖进行提取,提取温度比HWE法高,提取4.5 h后的提取率和得率都显著高于提取了6.0 h的HWE法(P<0.05)。陈孝云等[37]分别采用传统水提法、超声辅助法、微波辅助法、超声-微波协同提取法和复合酶法提取佛手多糖,其提取率均低于本文所采用的CPE法。这可能是因为天然植物的细胞壁在一定程度上会阻碍胞内多糖的释放,CPE法提取时会增加一定的压力,使细胞内外形成压力差,增强细胞的破壁作用,胞内多糖得到释放并溶于提取溶剂中,从而完成目标成分的提取[38]。而HWE法和其他方法是在常压下进行的,细胞壁的阻挡使得多糖的释放减少,故提取率比CPE法低。综合比较,CPE法的提取时间远少于HWE法,且操作简单、无需过滤,提取率和得率高,是一种高效的提取方法。

表6 CPE法与HWE法对比Table 6 Comparison between CPE method and HWE method

2.4 佛手多糖免疫调节活性研究

2.4.1 佛手多糖对RAW264.7细胞增殖的影响 采用MTT法检测细胞活性,不同浓度的佛手多糖对巨噬细胞的增殖活性结果如图2所示。从图2(a)中可看出,RAW264.7细胞的存活率随CCP浓度的增高而下降,具有剂量依赖作用,在10 μg/mL存活率(85.76%)最高,而当浓度高于500 μg/mL时,CCP则显著抑制了细胞的增殖(P<0.05);图2(b)中,CDP浓度对RAW264.7细胞的增殖作用大致呈现先上升后下降的“钟罩型”,存活率均大于81%,在浓度50～500 μg/mL时存活率大于95%,对RAW264.7细胞无明显损伤,在500 μg/mL浓度有最高存活率为99.4%;图2(c)中,HCP浓度为10～250 μg/mL时显著促进RAW264.7细胞的增殖活性,尤其是在10 μg/mL浓度时的促增殖能力最高(P<0.05),HCP浓度高于500 μg/mL时,RAW264.7细胞的促增殖能力随浓度增大而下降,在1000 μg/mL时的存活率低于80%(P<0.05);图2(d)中,HDP浓度对RAW264.7细胞的促增殖能力呈先下降后上升的波浪形趋势,RAW264.7细胞的存活率均大于96%,对RAW264.7细胞无明显毒性,在浓度为800 μg/mL时细胞存活率(144.09%)最高。综合考虑,低于500 μg/mL的佛手多糖浓度对RAW264.7细胞毒性较小,不会影响其增殖活性,选择0～500 μg/mL的佛手多糖浓度进行后续实验。

图3 佛手多糖对RAW264.7细胞NO分泌的影响Fig.3 The effect of bergamot polysaccharide on NO secretion of RAW264.7 cells

图4 佛手多糖对RAW264.7细胞吞噬活性的影响Fig.4 The effect of bergamot polysaccharide on phagocytosis activity of RAW264.7 cells

2.4.2 佛手多糖对RAW264.7细胞NO分泌量的影响 NO是一种重要的炎症介质,活化巨噬细胞可合成NO,参与细胞凋亡的调节和宿主对病原体或外来物质的防御;同时,NO也能促进巨噬细胞的溶解和吞噬[39]。由图3可知,四种多糖组分(CCP、CDP、HCP和HDP)均能提高RAW264.7细胞NO释放量。从图3(a)中可看出,CCP在浓度10～250 μg/mL范围内NO释放量无显著性差异(P>0.05),而在最高浓度500 μg/mL时,NO释放量(10.69 μmol/L)达到最大,显著高于空白对照组(0.35 μmol/L)和LPS阳性对照组(5.22 μmol/L)以及中低剂量组(P<0.05);图3(b)～(c)中,CDP和HCP浓度对RAW264.7细胞NO释放量具有剂量依赖性,NO释放量大致均随CDP和HCP浓度升高而升高,在25～500 μg/mL范围内的NO分泌量显著高于对照组和低剂量组(5～10 μg/mL)(P<0.05),CDP在200 μg/mL时有最大NO释放量(12.78 μmol/L),与LPS阳性对照组(13.33 μmol/L)无显著性差异(P>0.05),而HCP在浓度250 μg/mL时的NO分泌量为14.02 μmol/L,与LPS刺激组(13.19 μmol/L)无显著性差异(P>0.05),表明CDP和HCP都可以促进RAW264.7细胞NO的分泌,均具有良好的免疫活性;图3(d)中,HDP对应的NO释放量呈低浓度促进、高浓度抑制的“钟罩型”剂量依赖关系,与空白对照组、LPS阳性对照组和高剂量组(250～500 μg/mL)相比,中低剂量组(10～200 μg/mL)显著促进RAW264.7细胞分泌NO(P<0.05),在50 μg/mL时NO分泌量达到11.84 μmol/L,表明HDP也具有良好的免疫活性。与空白对照组相比,CCP、CDP、HCP和HDP在各自最佳有效浓度促进RAW264.7细胞释放NO能力分别提高了29.54、16.06、16.10和11.87倍,说明佛手多糖具有一定的免疫活性作用,与Peng等的报道一致[40]。

2.4.3 佛手多糖对RAW264.7细胞吞噬活性的影响 吞噬作用是巨噬细胞对病原体和癌细胞反应的主要特征之一[41]。测定活化巨噬细胞的吞噬能力可以反映受试样品对免疫功能的影响。图4中,CCP、CDP、HCP和HDP四种佛手多糖对RAW264.7细胞的吞噬能力的作用均大致随浓度上升呈先增加后下降的趋势,具有剂量依赖性。图4(a)和(b)中,CCP和CDP均在5 μg/mL时显著促进RAW264.7细胞吞噬活性(P<0.05),吞噬指数分别为208.00%和145.77%,显著高于LPS阳性对照组、空白对照组(以100%计,下同)和中高剂量组(P<0.05);图4(c)和(d)中,HCP和HDP在5～250 μg/mL浓度范围内可以很好促进RAW264.7细胞吞噬活性,吞噬指数均在100%以上,且两者分别在50和25 μg/mL时吞噬活性高达224.67%和157.81%,均显著高于LPS阳性对照组、空白对照组和其它剂量组(P<0.05)。与空白对照组相比,CCP、CDP、HCP和HDP在各自最佳有效浓度促进RAW264.7细胞吞噬作用能力分别提高了1.08、0.46、1.25和0.58倍。与脱除蛋白质的CDP和HDP相比,保留了部分活性蛋白的CCP和HCP促进RAW264.7细胞吞噬作用的能力更好,这可能是与糖蛋白和巨噬细胞表面上的特定受体结合有关[42]。

3 结论

本研究通过CPE和HWE两种方法提取佛手多糖,经过响应面优化设计得出两种方法提取佛手多糖的最佳条件为分别为:CPE提取温度99 ℃,时间4.5 h,流速66 L/h,提取率为16.09%±0.12%,得率21.31%±0.13%;HWE提取温度95 ℃,时间6.0 h(提取2次，每次3.0 h),液料比63 mL/g,提取率为15.43%±0.21%,得率20.22%±0.16%。与HWE法相比,采用CPE法使佛手多糖提取率提高了4.28%,得率提高了5.39%,并且缩短了1/4提取时间,表明CPE法适用于提取佛手多糖,为其他多糖的提取提供了一定的参考价值。

采用MTT法检测四种佛手多糖对RAW264.7细胞的毒性作用,结果表明当佛手多糖浓度低于500 μg/mL对细胞没有明显毒性;NO释放量和中性红吞噬能力的测定结果表明,四种佛手多糖均可促进RAW264.7细胞分泌NO和增加吞噬活性,且促进能力大小分别为CCP>HCP>CDP>HDP,HCP>CCP>HDP>CDP,说明由两种方法提取且经过醇沉和脱除蛋白质之后得到的四种佛手多糖均具有一定免疫调节活性,为药食同源的佛手资源深入开发利用和多糖增强免疫类保健食品和药物的研发提供一定参考。