析因设计探究温度与水分活度对美拉德反应模型的影响

黄杨斌,杜卿卿,任晓镤,彭增起,张雅玮

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

美拉德反应是广泛存在于食品加工与贮藏中的一类羰氨缩合反应[1],不仅能够应用于食品加工中影响产品的色泽和风味,还可作为加工食品中的抗氧化剂和抗褐变剂[2]、评估食品贮藏期间的营养品质[3]以及热反应香精的制作与利用等。随着人们对美拉德反应机理的研究深入以及应用技术的日益成熟,美拉德反应在食品加工中越来越受到重视。

美拉德反应的定向控制一直备受研究者们关注,然而美拉德反应过程十分复杂,受到诸多因素影响,反应底物氨基酸及糖的种类、结构都对反应剧烈程度和反应产物风味有较大的影响[4-7]。而反应过程中的外界条件特别是温度[8]和水分活度[9]也不容忽视,Lan等[10]研究了大豆肽-木糖美拉德模型在80～130 ℃下反应2 h的变化,肽段降解速率从临界温度100 ℃升高到120 ℃时会显著加快,苦味氨基酸和低分子肽会减少,Eric等[11]的研究表明温度的改变会使向日葵水解物美拉德反应产物色泽发生改变,并产生不同的挥发性风味物质,造成感官特性的变化;Cuzzoni等[12]的研究结果也表明温度的升高和水分活度的降低都会使核糖-赖氨酸和葡萄糖-赖氨酸美拉德模型产物褐变程度加深,这些研究都表明温度和水分活度在美拉德反应模型中的重要性。尽管早前有较多的美拉德反应条件相关研究文献,但水分活度对美拉德反应模型的影响研究较少,且温度和水分活度对美拉德反应的影响并非是独立作用的,应结合两者共同探究其影响,然而,水分活度对美拉德模型风味的作用以及水分活度和温度对美拉德反应的协同作用研究在国内却鲜有报道。

本研究采用析因试验设计,着重于美拉德反应的温度和水分活度两大因素,以猪肉酶解物和半胱氨酸、葡萄糖、六磷酸葡萄糖、硫胺素作为反应底物建立美拉德反应模型体系,研究反应温度和水分活度及协同交互作用对美拉德反应模型的影响,通过反应模型感官评分、褐变程度、电子鼻信号等指标进行探讨分析,并阐述其对模型色泽、气味的影响,为研究猪肉风味美拉德反应提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜猪里脊肉 江苏省苏食肉品有限公司;半胱氨酸盐酸盐、葡萄糖、硫胺素、六磷酸葡萄糖二钠、丙三醇、小苏打、复合蛋白酶(酶活≥120000 U/mg)、风味蛋白酶(酶活≥20000 U/mg) 上海瀚鸿科技股份有限公司;所有试剂及材料均为食品级。

便携式移液枪 德国EPPENDORF公司;D-1-70型高压蒸气灭菌锅 北京发恩科贸有限公司;PEN3型便携式电子鼻 德国AIRSENSE公司;DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;CP522C型电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司;Bante221型便携式pH计 上海般特仪器制造有限公司;MUL-9000型全自动纯水系统 南京总馨纯水设备有限公司;DU 730型紫外-可见分光光度计 美国Beckman Coulter有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 猪肉提取液的制备 猪肉提取液的制备参考文献[13]的方法并做修改。选取适量猪里脊肉,剔除可见脂肪及结缔组织并切成肉糜,称取肉样(100±0.5) g加入400 mL蒸馏水,于90 ℃水浴处理10 min,待冷却至室温用食用小苏打调节pH至中性,加入复合蛋白酶和风味蛋白酶(酶总量4%,比例1∶1)于50 ℃下酶解4 h,酶解完成后升温至95 ℃灭酶10 min,用砂布滤去肉渣得初滤液,于4000 r/min离心15 min,取上清液即为制备的猪肉提取液,待用。

1.2.2 美拉德反应模型体系的建立 实验选取2 mmol葡萄糖、1 mmol六磷酸葡萄糖二钠、1 mmol半胱氨酸、1 mmol硫胺素作为反应底物,添加水分活度αw为0.85、0.80、0.75(丙三醇添加量分别为4.00、5.40、7.11 g)的猪肉提取液5 mL溶解,添加小苏打调节pH至中性,建立美拉德反应模型体系,密封后置于高压灭菌锅中反应,设定反应时间70 min和温度为115、120、125 ℃,反应结束后冷却至室温,进行美拉德反应产物的色泽、气味评定分析。

1.2.3 析因实验设计 经过前期实验和文献参考[14-15]选取四种底物摩尔质量比即葡萄糖∶六磷酸葡萄糖二钠∶半胱氨酸∶硫胺素=2∶1∶1∶1溶于丙三醇与猪肉提取液混溶的混合液进行反应,以美拉德反应模型水分活度和温度分别设定3个水平,反应产物OD值、产物感官评分值以及电子鼻响应值为指标设计两因素三水平的3×3析因试验,因素水平组合表见表1。每组实验3次重复,3个平行。

表1 析因设计水平组合表Table 1 Combination table of factorial design

1.2.4 感官评定 本实验感官评定对该美拉德反应模型进行反应后色泽及风味评定,将美拉德反应模型风味细分为肉香味、焦糊味、硫刺激味和其他异味四种,先由经过培训的15名评定人员分别进行反应模型色泽、肉香味、焦糊味、硫刺激味和其他异味的强弱辨别评定实验,之后再依据感官评分标准进行嗜好程度感官评定,评定人员间独立进行不互相交流,各项评定分数结果取平均值。感官评定标准见表2。

表2 美拉德反应产物风味感官评定标准Table 2 Standard of sensory evaluation for the flavor Maillard reaction product

表3 PEN3电子鼻的标准传感器阵列Table 3 Details of 10 sensors for PEN3 portable electric nose

1.2.5 褐变程度的测定 由于420 nm处的紫外吸光度OD值可以用来检测美拉德反应褐变产物,以此来表示产物的褐变程度[16]。对反应完成的美拉德反应液取样,稀释30倍,于420 nm处测定产物吸光度,取平均值。

1.2.6 电子鼻检测 称取所需测定的各组样品0.8 mL置于10 mL顶空瓶中,加盖密封。置于30 ℃下加热10 min,依次用PN3型电子鼻进行上机检测。PN3电子鼻检测参数设置:传感器清洗时间100 s,归零时间10 s,样品准备时间5 s,样品测试时间120 s,初始注射流量80 mL/min,内部流量100 mL/min。为保证数据的稳定性和精确性,经实验选取测定过程中117～120 s的数据用于后续分析。表3为该型号电子鼻各传感器对应的检测对象及范围。

1.3 数据处理

实验数据统计使用IBM SPSS 22.0统计软件在显著性水平P=0.05下进行方差分析(ANOVA),用邓肯多重比较法(Duncan’s检验)进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 温度和水分活度对美拉德反应模型感官风味的影响

从表4析因结果分析,在115和125 ℃时,美拉德反应模型色泽评分值随水分活度降低而无显著变化(P>0.05);但120 ℃时,随着水分活度降低,模型色泽评分值升高(P<0.05)且水分活度为0.80试验组评分值最高。当水分活度为0.85时,模型色泽评分值随着温度的升高也无明显变化;但水分活度为0.80和0.75时,模型色泽评分值是随温度的升高而先升高后降低且120 ℃实验组评分值最高(P<0.05);当温度为120 ℃和水分活度为0.75或0.80时色泽感官评分最优。从主效应及方差分析结果得知,温度和水分活度都对美拉德反应模型色泽评分值有极显著影响(P<0.01),且温度与水分活度的相互作用对美拉德反应模型色泽评分值有显著性影响(P<0.05)。

在各水分活度(0.75、0.80、0.85)下,肉香风味感官评分值都随着温度的升高无明显变化;在各温度(115、120、125 ℃)下,肉香风味感官评分值随水分活度的升高而也无明显变化。且主效应和方差分析结果也表明,温度和水分活度都对美拉德反应肉香风味无显著性影响(P>0.05);温度和水分活度对美拉德反应肉香风味无显著性交互作用(P>0.05)。肉香味的产生主要是美拉德反应模型中常见的吡嗪类风味物质作用的结果,当100 ℃以下时吡嗪类物质产生较少,只有较为清淡的肉汤风味,而当温度达到100 ℃以上时吡嗪类物质会随反应时间的增加而增加,并产生较为强烈的烤肉香味[17]。吡嗪类风味物质主要是α-二羰基化合物和氨基酸通过Strecker降解反应产生[18],温度115～125 ℃和水分活度0.75～0.85反应条件可能没有明显地限制氨基酸的Strecker降解过程。

当美拉德反应温度为115和120 ℃时,水分活度对美拉德反应焦糊风味无显著性影响(P>0.05);而当温度为125 ℃时,0.85水分活度实验组焦糊风味感官评分值最高,比0.80水分活度实验组焦糊风味感官评分值高1.11(P<0.05),比0.75水分活度实验评分值高1.22(P<0.05),且该温度下焦糊风味感官评分值和水分活度呈正相关。当水分活度为0.85时,美拉德反应焦糊风味评分值随着温度的升高而先升高后降低(P<0.05),120 ℃实验组评分值最高,较于其他两温度组评分值高1.22;而水分活度为0.80和0.75时,美拉德反应焦糊风味评分值随着温度的升高而降低(P<0.05),125 ℃实验组评分值较于115、120 ℃组分别低了1.44和1.89、1.89和2.33。当温度为120 ℃时,美拉德反应焦糊风味评分值最优。从主效应分析来看,温度对美拉德反应焦糊风味评分值的影响大于水分活度。方差分析结果表明温度对美拉德反应焦糊风味有极显著性影响(P<0.01);水分活度对美拉德反应焦糊风味无显著性影响(P>0.05);温度和水分活度对美拉德反应焦糊风味有显著的交互作用(P<0.05)。焦糊风味是高温条件下美拉德反应中常见的带有焦糖及苦味的风味,焦糊风味主要是由呋喃和呋喃酮类风味物质作用产生,温度的升高会加速呋喃和呋喃酮类风味物质的生成,进而产生更浓厚的焦糊风味[19]。呋喃类风味物质主要来源于糖的焦糖化反应和碳水化合物的降解,而随着温度的升高呋喃类物质会显著增加[11],因此温度对焦糊风味的产生有较大的影响。

表4 美拉德反应模型感官评定结果分析Table 4 Analysis of sensory evaluation results of Maillard reaction model

当美拉德反应温度为115和120 ℃时,随着水分活度的降低,美拉德反应硫刺激风味评分值并未有显著的变化(P>0.05);而当温度为125 ℃时,美拉德反应硫刺激风味评分值随水分活度的降低而显著降低(P<0.05),水分活度为0.85时评分值为6.78最高,高出水分活度为0.75实验组1.22评分值(P<0.05)。当水分活度为0.85和0.80时,硫刺激风味感官评分值随温度的升高而无显著影响(P>0.05);而当水分活度为0.75时,拉德反应硫刺激风味评分值随温度的升高而降低(P<0.05),120 ℃实验组评分值最高且比125 ℃高1.33(P<0.05)。当温度为120 ℃和水分活度为0.75时,美拉德反应硫刺激风味评分值最高。再从主效应和方差结果分析,温度和水分活度对美拉德反应硫刺激风味无显著性影响(P>0.05),但温度和水分活度对美拉德反应硫刺激风味有显著的交互作用(P<0.05)。美拉德反应模型中的硫刺激风味可能来源于含硫底物半胱氨酸、硫胺素,Zhang等[20]研究温度和半胱氨酸对大豆蛋白美拉德反应产物的影响,发现添加半胱氨酸组比未添加组有更强的硫刺激肉香味。Eric等[11]也考察了温度和半胱氨酸对向日葵水解物美拉德反应产物感官特性的影响,结果表明半胱氨酸添加组随着温度的升高而噻吩类物质升高,而噻吩类风味物质是产生硫刺激气味的重要物质。然而,本研究结果表明单独的温度和水分活度的改变对于硫刺激风味的形成无明显影响(P>0.05),反映了尽管是较为极端的反应条件,硫化物前体物半胱氨酸和硫胺素的反应仍然不会太剧烈[17]。

在各水分活度(0.75、0.80、0.85)下,异味感官评分值都随着温度的升高无明显变化;在各温度(115、120、125 ℃)下,异味感官评分值随水分活度的升高而也无明显变化。方差分析结果也表明,温度和水分活度都对美拉德反应其他异味无显著性影响(P>0.05);温度和水分活度对美拉德反应其他异味无显著性交互作用(P>0.05)。美拉德反应模型中除产生一些比较明显的气味如肉香味、焦糊味、硫刺激味之外,还会生成较多的低阈值风味物质,由于这些风味较杂,故本研究中将其统称为其他异味。且本研究结果表明温度和水分活度改变并未对美拉德反应模型造成比较严重的异味影响。

由美拉德反应模型色泽风味的5组感官评定分析,综合情况下,9组实验组中温度为120 ℃、水分活度为0.75实验组无论色泽和风味感官评分都是最优的。

2.2 温度和水分活度对美拉德反应模型褐变程度的影响

从表5析因结果进行分析,当115和120 ℃时,随着水分活度的降低,美拉德反应产物OD值升高,水分活度为0.85和0.75的试验组产物OD值有显著变化(P<0.05),但115 ℃试验组颜色并无变化;当温度在125 ℃时,水分活度为0.80时反应体系OD值最高,即褐变程度最高且颜色最深呈棕色,相较于其他两水分活度实验组有显著性差异(P<0.05),较于0.75和0.85组分别显著升高了11.03%和10.73%。当水分活度在0.85、0.80和0.75时,随着温度的升高,美拉德反应模型OD值显著升高即褐变程度显著升高(P<0.05),模型色泽也逐步加深,从浅红色到橘红色,最后变成紫红色甚至棕色,125 ℃温度试验组模型OD值较于115 ℃组在不同水分活度0.85、0.80、0.75分别升高了81.25%、78.10%和57.02%。Zhang等[20]研究了温度80、100、120、140 ℃对大豆蛋白-核糖美拉德反应褐变程度的影响,温度的升高使美拉德反应产物于420 nm的OD值和色泽显著性升高。Lan[10]也研究发现大豆蛋白-木糖美拉德反应模型在80～130 ℃温度下在420 nm处吸光度随着温度的升高而显著升高。本研究显示当温度为125 ℃和水分活度为0.80时,产物OD值最大,即美拉德反应产物褐变程度最高且颜色最深。从主效应进行分析及方差分析结果得知,温度和水分活度都对美拉德反应产物褐变程度有极显著的影响(P<0.01),且温度与水分活度的相互作用对美拉德反应产物褐变程度有极显著影响(P<0.01)。

表5 美拉德反应模型褐变结果分析Table 5 Analysis of browning results of Maillard reaction model

美拉德反应褐变速率会受水分活度影响,水分活度低于反应最大褐变速率临界值时,褐变速率受分子迁移率的影响,水分活度升高褐变速率便会加快,而水分活度高于反应最大褐变速率临界值时,褐变速率主要受到水分子的影响,水分活度升高,水分子则越多而稀释了底物浓度,褐变速率被抑制[21-23]。有研究者表明水分活度在0.55～0.70之间美拉德反应褐变速率达到最大值[24-25],然而Eichner等[26]表明最适褐变速率的水分活度条件取决于反应物的类型。模型褐变主效应分析结果中水分活度升高而模型褐变程度先增大后减小,可能就如Bell[27]研究中所说不同反应模型的最大反应褐变速率临界值不同,而当水分活度高于当前反应体系最大褐变速率临界值时,水分子稀释了底物浓度,使分子间碰撞程度减弱,褐变速率减小。

2.3 温度和水分活度对美拉德反应模型电子鼻检测的影响

表6 美拉德反应模型电子鼻结果分析Table 6 Analysis results of the electronic nose of Maillard reaction model

从表6电子鼻析因结果可得,R1～R5传感器信号值都低于1.5,故温度和水分活度对美拉德反应模型产生的影响可能更多反映在R6～R10这几类传感器信号值中。

当温度为115 ℃时,甲基类物质(R6传感器)信号值随着水分活度的降低而降低(P<0.05)。当水分活度为0.85和0.80时,甲基类物质(R6传感器)信号值随着温度的升高而降低(P<0.05);水分活度为0.75时,甲基类物质(R6传感器)信号值随着温度的升高而先升高后降低(P<0.05)。从主效应及方差分析结果显示温度和水分活度都对模型产生甲基类物质有极显著的影响(P<0.01),且温度与水分活度的交互作用对模型产生甲基类物质有极显著影响(P<0.01)。猪肉主要风味物质中甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪以及2,6-二甲基吡嗪都是重要的甲基类物质,它们对反应模型中肉香味、坚果香、焦糖风味的产生贡献很大[20],温度和水分活度的改变使主要风味物质的产生发生变化。而对于模型中长链烷烃物质的产生,当温度为115和120 ℃时,长链烷烃物质(R10传感器)信号值随水分活度的降低而降低(P<0.05);而当温度为125 ℃时,长链烷烃物质(R10传感器)信号值随水分活度的降低而升高(P<0.05)。在水分活度为0.85和0.80时,长链烷烃物质(R10传感器)信号值随温度的升高而降低(P<0.05)。主效应及方差分析结果也表明温度和水分活度都对模型生成长链烷烃物质有极显著的影响(P<0.01),且温度与水分活度的相互作用对模型生成长链烷烃物质有极显著影响(P<0.01)。烷烃类物质是美拉德反应模型中常见的风味物质,这些物质的产生大部分可能是由于添加猪肉提取液的原因,而试验结果显示温度和水分活度的改变都对这类物质的产生有较大的影响。

在各温度(115、120、125℃)下,醇类物质(R8传感器)信号值随水分活度的升高而无明显变化。在水分活度为0.85时,醇类物质(R8传感器)信号值随温度的升高也无明显变化;水分活度为0.80和0.75时,醇类物质(R8传感器)信号值随温度升高而显著降低(P<0.05)。主效应及方差分析结果显示,只有温度对模型生成醇类物质有极显著的影响(P<0.01)。美拉德反应模型中产生的醇类物质在整体风味的形成上也发挥了重要作用,模型风味形成中多数不饱和醇如1-辛烯-3-醇和1-戊烯-3-醇都对反应模型风味有重要贡献[28],但它们几乎是通过热降解产生,故温度对醇类生成有较大的影响。然而本研究中温度的升高使醇类物质信号值降低,模型的感官香气却无明显变化,可能是试验温度限制了香气贡献低的醇类热降解反应的进行。

当温度为115和120 ℃时,无机硫化物(R7传感器)信号值随水分活度降低而降低(P<0.05);而当温度为125 ℃时,无机硫化物(R7传感器)信号值随着水分活度的降低而升高(P<0.05)。在水分活度为0.85和0.80时,无机硫化物(R7传感器)信号值随温度升高而降低(P<0.05);水分活度为0.75时,无机硫化物(R7传感器)信号值随温度升高而升高(P<0.05)。从主效应及方差分析结果可知,温度和水分活度都对模型生成无机硫化物有极显著的影响(P<0.01),且温度与水分活度的交互作用对模型生成无机硫化物也有极显著影响(P<0.01)。电子鼻R7传感器检测的无机硫化物主要是美拉德反应底物半胱氨酸和硫胺素通过Strecker降解反应产生的硫化氢类物质,而硫化氢类物质也可能在反应中生成有机硫化物[15],对于试验中温度和水分活度反应条件的改变使R7传感器信号值和感官硫刺激性气味都产生显著性差异,可能是它们抑制或促进半胱氨酸底物的反应速率。

在温度为115和120 ℃时,有机硫-芳香化合物(R9传感器)信号值即随水分活度的降低而降低(P<0.05);温度为125 ℃时,有机硫-芳香化合物(R9传感器)信号值却随水分活度的降低而升高(P<0.05)。当水分活度为0.85时,有机硫-芳香化合物(R9传感器)信号值随温度的升高而降低(P<0.05);水分活度为0.80时,115 ℃实验组的有机硫-芳香化合物(R9传感器)信号值显著高于其他两温度组(P<0.05);而水分活度为0.75时,125 ℃实验组有机硫-芳香化合物(R9传感器)信号值较于其他两组有显著性升高(P<0.05)。从主效应及方差分析结果可知,温度和水分活度都对模型生成有机硫-芳香化合物有极显著的影响(P<0.01),且温度与水分活度的交互作用对模型生成有机硫-芳香化合物也有极显著影响(P<0.01)。本研究中温度对模型有机硫-芳香化合物生成的结果与Zhang等[20]研究的温度与半胱氨酸对大豆蛋白-核糖美拉德反应模型产生有机硫-芳香化合物的结果基本一致。而含硫化合物及其衍生物也是美拉德模型中产生肉香味的重要风味物质[5],猪肉风味中存在许多重要的有机硫化物,如硫醇、噻吩、噻唑等,它们提供了重要的肉风味香气,温度和水分活度的升高都能引起这些物质的改变。

3 讨论与结论

由本实验结果可知,温度和水分活度对美拉德反应模型的影响并非独立的,研究反应中只考虑温度而忽视水分活度的作用是不准确的,模型中水分活度对模型中色泽和风味也存在显著性影响(P<0.05);而两者中的交互作用更是不可忽视,水分活度和温度的交互作用对美拉德反应模型色泽、焦糊风味、硫刺激风味以及产生的重要风味物质都有显著性甚至极显著的影响(P<0.05或P<0.01)。温度对美拉德反应模型褐变程度的影响结果正如Zhang[20]和Lan[10]研究的结果一致,即随着温度的升高,模型褐变程度越高,色泽越深,而水分活度以及两者交互作用虽不及温度对色泽与褐变程度影响大,但也有显著性影响(P<0.05);对于反应模型风味,温度对焦糊风味有极显著的影响(P<0.01),这可能是呋喃类物质在高温下急剧增加的原因;交互作用对焦糊风味、硫刺激风味都有显著性影响(P<0.05);对于受温度影响巨大的反应模型电子鼻响应值,除醇类物质外,水分活度和交互作用都对其他几种风味物质有极显著的影响(P<0.01);总体而言,水分活度和交互作用也对反应模型色泽、风味有显著性影响。本文中对于感官评分值和风味物质之间、褐变和色泽之间存在关系尚未加以分析,以及更低的水分活度条件影响,还需进行更多深入探究,但通过感官评定结果,暂定温度120 ℃和水分活度0.75条件下能获得更加理想的美拉德反应模型色泽及风味。