苏黄止咳胶囊对尘螨诱导哮喘小鼠气道炎症和黏液高分泌的影响

刘 蕾，王君兰，王 星

(1.内江市第二人民医院呼吸内科，四川 内江 641000； 2.成都市第三人民医院呼吸与危重症医学科，成都市呼吸健康研究所，成都 610000； 3.西南医科大学附属医院炎症与变态反应实验室，四川 泸州 646000)

支气管哮喘是一种2型免疫应答为主的慢性气道炎症性疾病，全球约3亿患者被支气管哮喘所困扰，最新的研究[1]显示我国20岁及以上哮喘患病人数达4570万之多，其中还未统计咳嗽变异性哮喘(CVA)等特殊类型哮喘，因此哮喘是呼吸系统常见多发病。有调查[2]显示，美国每年用于支气管哮喘的防治费用甚至高过肺结核及艾滋病治疗支出之和，在欧盟全年支气管哮喘的花费超过百亿欧元，因而支气管哮喘对社会、家庭和个人都带来了沉重的疾病负担和经济负担。气道黏液高分泌是哮喘主要的病理生理改变之一，尤其在重症哮喘和致死性哮喘发病机制和增加死亡率中起重要作用。控制气道的慢性炎症是哮喘治疗的核心，目前的临床上哮喘气道炎症控制主要依靠糖皮质激素治疗，但存在不良反应等问题限制其应用，并且缺乏显著减轻哮喘气道黏液过度分泌的药物。

苏黄止咳胶囊包含麻黄、紫苏叶、蜜枇杷叶、炒紫苏子、五味子、地龙、蝉蜕、前胡、炒牛蒡子9种中药成分，全国多中心随机对照研究和大量临床实践均证明苏黄止咳胶囊对CVA有较好的疗效[3]。但其对哮喘气道炎症和黏液高分泌的作用和机制目前尚不清楚，基于此，本研究通过构建尘螨诱导的哮喘小鼠模型，探讨苏黄止咳胶囊对其气道炎症和黏液分泌的影响和机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级C57BL/6J雌性小鼠(6～8周)购于成都达硕公司，尘螨(HDM)购于丹麦ALK公司，苏黄止咳胶囊(扬子江药业集团，批号：18040311)，Imject®Alum佐剂、cDNA合成试剂盒、DAB显色试剂盒购于赛默飞世尔公司，兔抗小鼠IgE和MUC5AC多抗购于Santa Cruz Biotechnology公司，iQTMSYBR®Green超混合液购于伯乐公司，刘氏染液和H&E染色试剂盒购于珠海贝索公司，免疫组化二抗购于武汉博士德公司，小鼠IL-4、IL-5和IL-13细胞因子ELISA试剂盒购于杭州联科生物公司，总RNA提取试剂盒购于上海飞捷公司，MUC5AC引物(F：5′-GCCAAGTGCCAAAAGCAGTAGAG-3；R：5′-GACCTGGGGTGTGGGTAGAAGA-3)和GAPDH引物(F：5′-ACCTGCCAAGTATGATGACATCA-3；R：5′-GGTCCTCAGTGTAGCC-CAAG-AT-3)合成于上海生工公司。

1.2 分组、哮喘模型构建与给药

将30只雌性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为对照组(PBS组)、哮喘组(Asthma组)和治疗组(SH组)，每组10只。哮喘组和治疗组分别在第0天和第7天进行腹腔注射HDM 20 μg和Imject®Alum佐剂(终体积1:1)，对照组腹腔注射相同体积PBS溶液。在第14天予以HDM 40 μg滴鼻激发，1次·d-1，连续7 d，其中治疗组小鼠于每次激发前2 h予苏黄止咳胶囊药粉3.5 g·kg-1(溶于200 μL PBS溶液)灌胃[4]，哮喘组和对照组均以PBS溶液代替处理。

1.3 气道高反应性(AHR)检测

末次激发后24 h，将各组C57BL/6J小鼠分别放入无创全身体描检测系统(WBP)，测定基线增强呼气间歇(Penh)值后予分别雾化6.25、12.5、25、50、100 mg·mL-1的乙酰甲胆碱(Mch)并记录各只小鼠Penh值。

1.4 血清收集

测量AHR 24 h后，各只小鼠摘除眼球取血收集于1.5 mL EP管中，待血液凝固后吸取血清，储存于超低温冰箱待检。

1.5 支气管肺泡灌洗液(BALF)获取及细胞分类计数

各组小鼠气管切开后予气管插管，注入800 μL预冷PBS溶液，缓慢来回抽吸5次，每只小鼠重复3次。肺泡灌洗液1500 r·min-1离心15 min后弃去上清液，以500 μL PBS溶液重悬沉淀细胞，取重悬液20 μL计数细胞总数。再取PBS细胞悬液200 μL滴于载玻片进行刘式染色，光镜下分类计数炎症细胞。

1.6 肺组织HE染色及PAS染色

分离各组小鼠肺组织后10%中性甲固定，常规包埋切片，按试剂盒说明书进行肺组织切片H&E染色和PAS染色。

1.7 肺组织免疫组织化学染色

肺组织石蜡切片至水后放入高压修复3 min，正常山羊血清37 ℃湿盒封闭40 min，再滴加1:200稀释的兔抗鼠MUC5AC抗体4 ℃过夜，PBS溶液洗3 min，重复3次，使用3%双氧水/甲醇溶液封闭20 min后PBS溶液洗3 min，重复3次，加入羊抗兔二抗工作液于37 ℃孵育40 min，PBS溶液洗10 min，重复3次，随后滴入SABC于37 ℃孵育30 min，PBS溶液洗3 min，重复3次，滴入DAB显色后水洗苏木精复染，封片后光镜下观察。

1.8 肺组织实时荧光定量PCR

无菌分离各组小鼠肺组织，根据说明书使用RNAfast200总RNA提取试剂盒提取总RNA，按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA，再按iQTMSYBR®Green超混合液说明书配置20 μL反应体系上机：95 ℃预变性3 min→95 ℃变性15 s→57 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s→采集荧光，40个循环后溶解曲线55～95 ℃(增量0.5 ℃)15 s。使用2-△△Ct法相对定量分析结果。

1.9 ELISA法检测尘螨特异性IgE(HDM-sIgE)

96孔板用1 μg·mL-1HDM+CBS抗原包被液每孔100 μL 4 ℃包被过夜，PBST溶液清洗5 min，重复3次，随后每孔200 μL封闭液(3%牛血清白蛋白)于37 ℃封闭2 h，使用1%牛血清白蛋白按1:5稀释血清，每孔加入100 μL稀释血清于37 ℃孵育2 h，PBST溶液清洗5 min，重复3次，随后用1%牛血清白蛋白按1:2000稀释IgE抗体，加入后37 ℃孵育2 h，PBST溶液清洗5 min，重复3次，加入100 μL TMB后37 ℃条件下避光孵育15 min，最后2 mol·L-1硫酸滴入终止反应，450 nm波长检测各孔OD值。

1.10 原代脾细胞培养及细胞因子检测

超净工作台内分离各组小鼠脾脏，经200目尼龙网过滤成单细胞悬液，加入RBC裂解液裂解后，1500 r·min-1离心(4 ℃)5 min，使用含10%FBS和双抗的RPMI1640重悬，5×106每孔浓度加入无菌24孔板，每孔再加入200 μg HDM后37 ℃条件下孵育72 h后离心，上清按ELISA试剂盒说明书检测IL-4、IL-5和IL-13细胞因子浓度。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 气道高反应性

通过尘螨过敏原构建C57BL/6J小鼠哮喘模型，使用WPB系统检测末次激发24 h后各组小鼠在各浓度Mch刺激下的增强呼气间歇值，结果见图1，Asthma组Penh值明显高于PBS组(均P<0.05)，表明本研究成功诱导小鼠出现气道高反应；SH组Penh值较Asthma组显著降低(均P<0.05)，表明苏黄止咳胶囊可改善尘螨诱导的小鼠气道高反应性。

2.2 肺组织切片HE染色

PBS组小鼠气道上皮完好齐整，很少见到炎症细胞，管腔通畅，Asthma组小鼠气道以及血管旁可见炎症细胞大量浸润，支气管上皮可见缺损坏死脱落，管腔内可见到有局部黏液栓形成；而SH组上述肺部改变显著减轻，炎细胞浸润减少，支气管上皮得到恢复(图2)。表明尘螨过敏原成功诱导小鼠出现气道炎症，苏黄止咳胶囊可减轻小鼠气道炎症病变。

2.3 支气管肺泡灌洗液细胞分类计数

小鼠BAL F沉淀细胞PBS重悬后行刘氏染色，光镜下炎症细胞分类计数可见Asthma组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS)数量明显高于PBS组(P<0.05)，SH组小鼠肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞数量较Asthma组显著减少(P<0.05)，见图3—4。表明尘螨抗原刺激诱导小鼠气道嗜酸性粒细胞浸润，而苏黄止咳胶囊可减少其气道嗜酸性粒细胞为主的炎细胞浸润。

2.4 肺组织切片PAS染色

Asthma组PAS糖原染色阳性细胞显著多于PBS组，SH组杯状细胞则比Asthma组显著减少(图5)。表明尘螨诱导小鼠气道黏液高分泌，苏黄止咳胶囊可减轻哮喘小鼠气道杯状细胞增生和黏液高分泌。

2.5 肺组织MUC5AC mRNA的表达

Asthma组肺MUC5AC mRNA表达水平显著高于PBS组(P<0.05)，而SH组比Asthma组显著减少(P<0.05)，见图6。表明苏黄止咳胶囊可下调尘螨诱导哮喘小鼠气道MUC5AC的mRNA表达。

2.6 气道MUC5AC蛋白的表达

MUC5AC蛋白显示为棕黄染色，Asthma组阳性染色明显强于PBS组，SH组阳性染色则比Asthma组减少(图7)。表明苏黄止咳胶囊可减少哮喘小鼠气道MUC5AC蛋白表达。

2.7 尘螨特异性IgE检测

Asthma组血清HDM-sIgE含量显著高于PBS组(P<0.05)，而SH组血清HDM-sIgE含量比Asthma组明显降低(P<0.05)，见图8。表明尘螨诱导小鼠HDM-sIgE升高，苏黄止咳胶囊可减少HDM-sIgE分泌。

2.8 脾细胞上清液细胞因子检测

Asthma组IL-4、IL-5和IL-13水平较PBS组显著升高(均P<0.05)；SH组IL-5和IL-13水平较Asthma组显著降低(P<0.05)，IL-4水平略有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图9—11。

3 讨论

苏黄止咳胶囊包含9种中草药成分，以麻黄为君药，宣散肺中之邪，平喘止咳；紫菀和五味子为臣药，收敛肺气，化痰止咳；紫苏子和前胡等为佐，既可强化麻黄的疏风作用，又能增加升降相协之能力；再配合地龙和蝉蜕等疏散风邪、利咽止痒为使[5]。有研究[6-7]证实苏黄止咳胶囊对CVA有较好的疗效，可降低哮喘气道AHR，还有报道其具有调节免疫的功能，可纠正患儿外周血T淋巴细胞亚群紊乱。程莉等[8]证明苏黄止咳胶囊能协同改善老年COPD患者肺功能，并通过降低血清中IL-6和IL-8水平调节非特异性气道炎症。

哮喘气道炎症细胞浸润包括EOS、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞等，其中EOS在过敏性哮喘的发病中发挥十分重要的作用[9]。本研究通过成功复制尘螨诱导哮喘小鼠模型，发现经苏黄止咳胶囊治疗后，小鼠BAL F中炎细胞计数和EOS数目显著下降，气道炎症浸润明显减少，同时气道高反应性得到了明显改善，证实了其对尘螨诱导气道炎症和高反应性的改善作用。

黏液分泌亢进是哮喘患者，尤其是重症哮喘患者发病和死亡率增加的重要原因。气道黏液分泌的主要蛋白成分是粘蛋白，主要由杯状细胞分泌。哮喘患者气道黏液高分泌主要表现为杯状细胞增生并分泌大量MUC5AC粘蛋白，这与气流受限和AHR也密切相关。本实验中，PAS染色显示苏黄止咳胶囊治疗后，小鼠气道中杯状细胞增生明显减轻，同时粘蛋白MUC5AC的蛋白表达水平以及mRNA水平均得到不同程度的抑制，证明苏黄止咳胶囊可以减轻尘螨过敏原诱导的气道黏液过度分泌。

哮喘的主要发病机制之一是2型辅助T淋巴细胞(Help T cell 2，Th2)数目增多和功能亢进，Th2细胞参与宿主对于细胞外病原的免疫防御，主要分泌细胞因子IL-4、IL-5和IL-13[10-11]。白细胞介素4和13能诱导B细胞产生大量sIgE抗体，sIgE进一步结合到嗜碱性粒细胞、肥大细胞等效应细胞的高亲和力受体上，当其再次接触同种过敏原，引发下游炎症介质瀑式放大，产生平滑肌痉挛、黏液分泌亢进等反应，表现为哮喘临床症状发生[12]。有研究[13]证实过表达IL-13可成功构建过敏性哮喘小鼠模型，下调IL-13能减轻哮喘气道高反应性、气道炎症和黏液高分泌。IL-5又称嗜酸性粒细胞集落刺激因子，是调节EOS增殖活化的重要因子，可促进嗜酸粒细胞分泌白三烯和组织胺等炎症介质。使用单克隆抗体阻断IL-5通路可显著减轻小鼠肺组织的EOS浸润，改善病毒诱发的哮喘恶化[14]。为了进一步探究苏黄止咳胶囊减轻气道高反应和黏液高分泌的机制，本研究发现通过苏黄止咳胶囊治疗虽然IL-4的表达水平没有显著降低，但可以有效减少IL-13和IL-5的表达，抑制B淋巴细胞合成释放尘螨特异性IgE抗体，减轻嗜酸性粒细胞为主的气道炎症浸润、气道高反应性和黏液高分泌。初步证实了苏黄止咳胶囊对过敏性气道炎症和黏液过度分泌的疗效机制，为进一步从复合配方中寻找新的小分子药物控制哮喘提供了方向。