都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop区遗传多态性研究

李芳玉 ，黄光云，王自豪，滕少花，曹艳红，孙俊丽，雷初朝，廖玉英*

（1.广西壮族自治区畜牧研究所，广西家畜遗传改良重点实验室，广西南宁 530001；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

家养山羊是在人类生产生活中发挥重要作用的家畜品种之一。通过山羊形态多样性研究，《中国羊品种志》提出弯角野山羊（Capra aegagrus）和旋角野山羊（Caprafalconeri）是现代家养山羊的野生祖先[1]。由于哺乳动物mtDNA具有母系遗传、不重组、进化速度相对较快等特点，因此mtDNA是研究动物遗传多样性和起源进化的重要遗传标记。基于mtDNA序列研究发现，全世界山羊共有7个支系（A-G）[2-7]。利用现代生物技术研究山羊的分子遗传多样性，对了解山羊的起源、分化以及山羊的品种资源保护和利用有重要作用。

都安山羊和隆林山羊均为广西壮族自治区的地方肉用山羊品种，具有抗逆性强、耐粗饲的优点[1]。但近年来，由于生态环境恶化和选留种不科学等原因，都安山羊和隆林山羊出现生产质量下降和品质退化的现象[8]，因此，保护这2个地方山羊品种资源刻不容缓。本研究采用PCR扩增、DNA测序和生物信息学方法，对都安山羊和隆林山羊共58个个体的mtDNA D-loop区全序列进行检测，以研究这2个地方山羊品种的遗传多样性和母系起源，为我国地方山羊品种资源的保护和育种利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集及基因组DNA的提取 在广西壮族自治区大化县养殖场采集35只都安山羊，在隆林县隆林山羊保种场采集23只隆林山羊的耳组织样，所采个体符合品种特征，为避开样本个体间的亲缘关系，本研究根据家系信息来采取山羊耳组织样品，低温保存带回实验室，用常规酚-氯仿法提取基因组DNA，稀释浓度至10～20 ng/μL，保存备用。从NCBI网站上查找并下载2条野山羊序列作为对照，一条为弯角野山羊序列（登录号：AB044306）；另一条为旋角野山羊序列（登录号：AB004076）。下载家山羊mtDNA D-loop区全序列A、B、C及D支系各1条做对照，登录号分别为AB004082、KM464500、AB110555和AB110587。

1.2 引物合成和扩增 本研究引用刘若余等[9]和郝荣超等[10]对中国山羊mtDNA D-loop区全序列研究所用的引物。上游引物F：5´-CAGTCGAACATCCCTACATTA TTATTGG-3´，下游引物R：5´-TTAGTCTTATTGATTT GGAGGGCGTTA-3´，中间引物I：5´-ATGCGTATCC CGTCCACTAGATC-3´，送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR体系25 μL：2×PrimeSTAR Max Premix（上海宝生物公司）10.5 μL，上、下游物（10 pmol/μL）各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，超纯水12.5 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃复性 60 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶（含GoldView核酸染料）电泳后，凝胶成像系统拍照检测，对扩增效果进行检查。将符合要求的PCR产物送到上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.3 数据分析 用seqman对山羊mtDNA D-loop全序列测序结果进行拼接和校正。用MEGA7将都安山羊和隆林山羊的mtDNA D-loop序列与标准序列进行同源序列比对分析，并辅以人工校正。用MEGA7构建这2个山羊品种的单倍型NJ系统发育树。用DnaSP6软件计算山羊的mtDNA D-loop单倍型多样度、核酸多样度以及平均核酸差异数。

2 结果与分析

2.1 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop全序列长度和碱基构成 从35只都安山羊和23只隆林山羊mtDNA D-loop区的PCR产物中随机选取10个样本，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，条带明亮清晰，没有杂带，长度在1 000～2 000 bp（图1）。通过测序测定58个个体的mtDNA D-loop全序列长为1 212～1 213 bp，其中有42个个体为1 212 bp，16个个体为1 213 bp，这是由于在1 074 bp处插入1个碱基C造成的。4种碱基A、T、G和C平均百分比分别为31.3%、28.8%、13.9%和26.0%。A+T含量为60.1%，G+C含量为39.9%，A+T含量显著高于G+C含量。

2.2 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop区全序列多态性分析 通过对都安山羊和隆林山羊共58个个体的mtDNA D-loop区全序列进行测序分析，检测到83个多态位点（图2），定义32个单倍型，其中都安山羊有22个单倍型，隆林山羊有16个单倍型，二者有6个单倍型是共享的。都安山羊和隆林山羊的单倍型多样度分别为0.956和0.960，其核苷酸多样度均为0.018，其平均核苷酸差异数（k）分别为21.2和21.5。

2.3 都安山羊和隆林山羊mtDNA D-loop序列的聚类分析将都安山羊和隆林山羊32个mtDNA D-loop区单倍型与旋角野山羊、弯角野山羊以及家养山羊A、B、C和D支系对应序列进行聚类分析（图3），发现都安山羊和隆林山羊分为2个支系，分别为A支系和B支系，其中A支系包含弯角野山羊，而旋角野山羊作为外群，单独聚为一支。

3 讨论

本研究测定的35只都安山羊和23只隆林山羊的mtDNA D-loop区全序列长为1 212～1 213 bp。刘若余等[9]测定了9个中国山羊品种共128个个体的mtDNA D-loop区序列，结果得出9个中国山羊品种的单倍型多样度均高于0.9，表明中国山羊遗传多样性丰富。郝荣超等[10]测定了10个中国南部山羊品种140个个体的mtDNA D-loop区序列，其平均单倍型多样度和核苷酸多样度分别为0.988、0.021，说明中国山羊具有丰富的遗传多样性。在都安山羊和隆林山羊中共发现83个多态位点，32个单倍型，其单倍型多样度分别为0.956和0.960，核苷酸多样性均为0.018，说明都安山羊和隆林山羊也具有丰富的遗传多样性。

由于山羊最初家养的地方与弯角野山羊的地理分布（中亚西亚的诸多山脉）有高度的相关性，因此有研究者推测弯角山养是最可能的母系起源[11]。通过mtDNA D-loop区序列研究，发现中国山羊共有4个支系（A-D）[7,9-10,12]。李祥龙等[13]研究中国18个地方山羊品种的mtDNA RFLP多态性，发现2个基本单倍型I和II，提出中国山羊可能是弯角野山羊与旋角野山羊的混合起源，由于该文并没有使用弯角野山羊与旋角野山羊样本进行分析，因此，李祥龙等[13]提出的中国山羊混合起源学说仅仅是推测。刘若余等[10]研究发现，中国山羊品种主要为A和B支系，且只在西藏山羊中发现C和D 2个支系。此外，有研究对来自不同地理区域的中国山羊品种进行分析，在太行、内蒙古等地区的山羊品种中检测到D支系，而其他地区的家山羊品种则为A和B支系[12]。根据系统发育树可以看出，都安山羊和隆林山羊32个单倍型分为A和B 2个支系，说明都安山羊和隆林山羊有2个母系起源，其中弯角野山羊与A支系聚在一起，而旋角山羊单独聚为一支，说明弯角野山羊是都安山羊和隆林山羊的母系起源，尚未有证据表明旋角山羊对都安山羊和隆林山羊的母系遗传有贡献。

4 结论

本研究对35只都安山羊和23只隆林山羊的mtDNA D-loop区进行多态性分析，结果表明都安山羊和隆林山羊具有丰富的遗传多样性；通过构建NJ发育树，发现都安山羊和隆林山羊主要分为A支系和B支系，其中A支系与弯角野山羊聚在一起，而旋角野山羊单独聚为一支，说明弯角野山羊是都安山羊和隆林山羊的母系祖先。