阿司匹林对缺血性脑梗死神经元细胞凋亡的影响及机制

吴 健 黄玉梅 张玲玲 吕秀华

三明市妇幼保健院，三明，365000，中国

阿司匹林是一种经典的广谱非甾体抗炎药，临床上已被广泛应用于抗炎、解热镇痛和抗风湿。此外，由于阿司匹林血脑屏障通透性好，且具有较强的抑制血小板聚集的作用，因此可用于心脑血管疾病的预防［1-2］。近年来，越来越多的实验证实阿司匹林具有直接的神经保护作用，但其具体机制还有待探究［3-4］。在此，本研究拟通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤脑梗死模型，对大鼠采用阿司匹林预给药观察其脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及其调节蛋白等表达方面的影响，旨在进一步揭示阿司匹林发挥直接神经保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SD 雄性大鼠90 只，体质量240～330 g，购于南京青龙山动物繁殖场，生产许可证号：SCXK（苏）2017-0029，质量合格证号：2020001636430，于实验规定要求条件下饲养，饮用水及饲料等均经灭菌消毒处理。

1.2 主要试剂与仪器

阿司匹林肠溶片，购自中美上海施贵宝制药有限公司，规格：100 mg，批准文号：国药准字J20 130078；脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP 缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡原位检测试剂盒，购自德国Roche公司，批号：11782 418713；兔抗大鼠B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 基因（Bcl-2 associated X protein，Bax）、细胞色素C（cytochrome C,Cyt-C），β-肌动蛋白（β-actin）抗体，批号：SC-8013、SC-5423、SC-7622，SC-6219。

WH -367 型微量移液器，德国Eppendorf 公司；CKX41 型倒置显微镜，日本Olympus 光学工业株式会社；CM 1900 型冷冻-切片机，德国徕卡公司；Western blot 显影仪，美国Thermo Scientific。

1.3 大鼠分组、给药及缺血性脑梗死模型的建立

将90 只SD 雄性大鼠随机分为对照组（行假手术）、模型组、阿司匹林组，每组30 只，阿司匹林组术前5 d连续给予50 mg·kg-1剂量的阿司匹林灌胃（将阿司匹林片用生理盐水配制10 mg·mL-1的混悬液），其余两组给予等量生理盐水。D 6 开始造模，术前12 h 禁食不禁水，用10%水合氯醛将大鼠麻醉后背位固定，切开颈部，分离颈总动脉，使用无损伤动脉夹将双侧颈总动脉夹闭10 min，随后松开动脉夹使血管再通，建立短暂性脑缺血再灌注损伤脑梗死模型。手术过程中保持大鼠肛温在（37±0.5）℃，术中若发现大鼠瞳孔散大、翻正反射消失表明造模成功，而若发现大鼠瞳孔固定、四肢强直、痉挛抽搐，或术后无症状、意识丧失，不能自发行走者则予以剔除。术后做好伤口消毒，预防感染，待大鼠清醒后使其自由接触水和食物。

1.4 TUNEL 法检测大鼠脑组织神经元细胞凋亡情况

术后24 h 每组各取6 只大鼠固定，完成麻醉等操作后断头取脑，先用0.01 mol·L-1的PBS 溶液在体灌注，再用4%多聚甲醛灌注并固定4 h，PBS 溶液冲洗3～4 次，然后置于流水中漂洗过夜，次日再用PBS 溶液冲洗3～4次，最后依次转入20%、25%，30%的蔗糖液中脱水沉底。将脱水后的脑组织用冷冻-切片机全程冷冻切片（切片厚度：50 μm）。大鼠脑组织切片按照TUNEL 法细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行神经元细胞凋亡情况检测。每张经处理后的切片在显微镜下随机选取10 个视野，对视野内的细胞进行计数，并计算细胞凋亡率。

1.5 大鼠脑组织神经元细胞总蛋白及胞浆蛋白的提取

大鼠按上述方法断头取脑，取部分脑组织放入液氮灌中冻存备用。从液氮中取出冻存脑组织在冰水浴的条件下参照RIPA 细胞组织裂解液说明操作进行总蛋白提取。此外，每组取部分等量冻存脑组织加入1∶10（w/v）冰冷的匀浆缓冲液，使用Glas-Col 匀浆器高速匀浆，匀浆完成后于4℃条件下1 000 g 离心15 min，小心移取上清液，该上清即脑组织神经元细胞胞浆部分，同法提取蛋白后采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）法进行蛋白定量。

1.6 Western blot 技术检测大鼠脑组织神经元Bcl-2、Bax 蛋白表达及Cyt-C 释放量

分别取50 μg 总蛋白及胞浆蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。根据相对分子质量在电泳后的凝胶上切取目标蛋白条带，采用半干转膜法转移至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，PVDF 膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h，加入Bcl-2、Bax、Cyt-C（胞浆蛋白）和β-actin 一抗（稀释比例为1∶1 000），4℃孵育及轻摇过夜；洗膜后加入相应HRP 标记的二抗（稀释比例为 1∶50 000）孵育2 h，用含吐温磷酸盐缓冲液（TPBS）洗涤后加入发光聚合物（ECL），于WB 显影仪内观察拍照。用Image J 软件计算各蛋白条带的灰度值，目标蛋白的相对表达量用目标蛋白条带灰度值与内参β-actin 条带灰度值的比值表示。

1.7 统计学方法

本次实验所获得的数据用SPSS 22.0 统计学软件进行处理，计量资料以表示，计数资料比较使用χ2检验，组间差异的比较采用t检验，以P＜0.05 计为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠脑组织神经元细胞凋亡情况

与对照组相比，模型组大鼠脑组织神经元细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿司匹林组大鼠脑组织神经元细胞凋亡表达数显著降低，其与对照组相比仍存在一定的差异，以上差异均具有统计学意义（P＜0.05，Fig.1）。

Fig.1 TUNEL staining was used to observe neurons in rat brain apoptosis（×200%，n=6）

2.2 大鼠脑组织神经元Bcl-2、Bax 蛋白表达及Cyt-C释放情况

与对照组相比，模型组大鼠脑组织神经元细胞凋亡相关蛋白Bax 表达显著升高，Bcl-2 表达显著降低，由线粒体释放入胞浆的Cyt-C 的量显著增加（P＜0.05）；与模型组相比，阿司匹林组大鼠脑组织神经元细胞凋亡相关蛋白Bax 蛋白表达及Cyt-C 释放量显著降低，而Bcl-2 表达显著增加（P＜0.05）；三组间各蛋白表达差异均存在统计学意义（P＜0.05，Fig.2）。

Fig.2 Western blot analysis of neurons in rat brain,the expression of apoptosis related proteins (，n=6）

3.讨论

阿司匹林作为一种临床常用药物，因其具有较强的抗血小板聚集作用，而被广泛用于缺血性脑血管病的防治。近年来，不少体外及体内实验均证实阿司匹林具有直接的神经保护作用。例如Crdlli M 等发现，体外培养的小脑颗粒细胞预先加入阿司匹林可明显减轻谷氨酸引发的细胞死亡［5］。Khayyam 等在建立大鼠局灶性脑缺血模型前给予大鼠阿司匹林，一周后处死大鼠，发现当阿司匹林剂量≥15 mg·kg-1能明显缩小脑梗死体积，减轻缺血性脑损伤［6］。虽然已有不少研究证实阿司匹林的直接神经保护作用，但其具体机制还尚不明确，有待进一步探究。

本研究采用阿司匹林预给药的方式探究了该药对缺血性脑梗死大鼠脑组织神经元细胞凋亡的影响及机制，实验结果显示TUNEL 法检测阿司匹林组脑组织神经元细胞凋亡率虽略高于对照组，但明显低于模型组，该结果表明阿司匹林能有效抑制大脑神经元细胞的凋亡，从而产生直接的神经保护作用。有研究表明由脑缺血引发的神经元细胞凋亡的分子机制均涉及Bcl-2 和Bax 蛋白表达的变化［7-8］，Bcl-2 及Bax 蛋白均位于线粒体上游，其能够调节线粒体膜的通透性，其表达的变化可控制Cyt-C 由线粒体释放至胞浆及下游Caspase 3 蛋白酶的活化，促进细胞存活及介导其凋亡。其中Bcl-2 属于抗凋亡蛋白，而Bax 则是与Bcl-2 作用对抗的促凋亡蛋白［9］。在死亡信号的作用下，Bax 能够移位至线粒体膜上，通过形成二聚体或多聚体的形式在线粒体膜上产生通透性PT 孔道，形成膜内外浓度差，使Cyt-C 从膜内释放入胞浆。Cyt-C 在dATP 存在的条件下与Apaf-1 结合形成凋亡体，招募并活化Pro-Caspase-9，进而激活Caspase-3，启动Caspase 级联反应，促进细胞凋亡［10-11］。而作为具有抗凋亡作用的Bcl-2 蛋白过表达一方面能够与Bax 结合形成异源二聚体，限制Bax 的移位，关闭PT 孔道，阻断Cyt-C 由线粒体膜内释放入胞浆，抑制Caspase-3 的活化，从而抑制细胞凋亡。另一方面，Bcl-2 还能与Apaf-1 产生抑制型结合，阻止Pro-Caspase-9 活化发挥抗凋亡作用。此外，还有研究发现Bcl-2 的过度表达可引发胞核GSH 积聚，改变核内氧化还原反应平衡，限制胞内Ca2+流动，抑制线粒体释放Cyt-C 入胞浆，从而抑制Caspase-3 的活化，阻断凋亡发生与发展［12］。本实验的Western blot 结果显示阿司匹林组大鼠脑组织神经元的Bax、Bcl-2、Cyt-C 蛋白表达量虽与对照组相比还存在一定的差异，但与模型组相比，阿司匹林组大鼠脑组织神经元Bax 蛋白表达及Cyt-C 释放量显著降低，而Bcl-2 蛋白表达显著增加，表明阿司匹林可以通过调节Bax 及Bcl-2 蛋白的表达，抑制线粒体释放Cyt-C 的机制显著减少脑组织神经元的细胞凋亡。

综上结果表明阿司匹林可通过抑制神经元细胞凋亡对缺血性脑梗死产生防治作用，其抗凋亡的机制涉及抑制促凋亡蛋白Bax 表达，同时提高抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，以及稳定神经元线粒体膜。