基于网络药理学研究赤芍防治肝癌的作用机制

尤斯涵 白景茹 王治宝 谭晓虹 郭春燕

河北北方学院药学系，张家口，075000，中国

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），即通常所说的肝癌，是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌肿，是我国常见的恶性肿瘤之一，目前全世界约有一半的肝癌病例来自我国［1］。近年来，HCC 的发病率呈上升趋势［2］。此外，HCC 具有早期很难被发现、潜伏期长、易转移等特性［3］，而这些特性都严重制约了HCC患者的生存和预后［4］。中医药理论有雄厚的基础，用药广泛，如果进行合理的治疗，会有良好的疗效，可以最大程度的减少并发症。

赤芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactifloraPall.）或川赤芍（Paeonia veitchiiLynch）的干燥根［5］。其味苦，性微寒，归肝经，在《神农本草经》和历代医籍文献中均有记载，是我国常用的传统中药材［6］。赤芍中含有芍药苷［7］、芍药醇、有机酸［8］等活性成分，具有十分广泛的药理作用。其中抗肿瘤的机制备受瞩目，随着现代医学技术的发展，多项研究均证实赤芍及其有效成分具有很好的抗肿瘤作用［9］。

中医、中药讲究治养兼并和整体观、全局观。网络药理学方法在解释中药多组分、多靶点协同作用方面具有优势［10］。网络药理学是在系统药理学高速发展的基础上建立的，能够系统地观察药物对疾病网络的干预及影响，也能从基因分子角度解释药物的作用机制，为后续赤芍治疗肝癌的实验提供理论依据［11］。

1 材料与方法

1.1 赤芍化学成分、作用靶点数据来源及标准化

TCMSP 数据库（https：//tcmspw.com/tcmspsearch.php），以“赤芍”为关键词检索赤芍中的化学成分。筛选出赤芍化合物中符合OB（口服生物利用度）≥30%和DL（生物活性分子的类药性）≥0.18 的化学成分作为活性成分。根据化学相似性，通过STD 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和SEA 数据库（http：//sea.bkslab.org）进行化学活性成分的靶点预测并利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库将靶点名称转化为Uniprot 号。通过Cytoscape3.2.1 软件绘制赤芍活性成分-靶点网络图。通过拓扑学指标“度”值进行筛选得到赤芍活性成分-靶点核心网络图。

1.2 肝癌相关靶点的获取及标准化

通过TTD数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank 数据库（https：//www.drugBank.ca/）、OMIM数据库（http：//www.omim.org/），以“Hepatocellular Carcinoma”为关键词，物种限定为“Humans”，对肝癌靶点进行搜索。整理已获得靶点并利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库将其转化为Uniprot 号。所有已收集并整理的靶点为之后的研究和分析提供靶点信息。通过Cytoscape 3.2.1 软件绘制肝癌-靶点网络图。

1.3 靶点的映射

将上述预测的活性成分靶点及肝癌相关靶点通过Excel 进行映射，找到赤芍与肝癌作用的共同预测靶点。

1.4 PPI 网络构建

将上述所映射的共同靶点上传至STRING 数据库（https：//string-db.org/）中，整理蛋白之间相互作用网络（protein protein interaction network，PPI network），取“combined_score“值为0.9 以上的相关蛋白，并以“TSV”格式保存。通过Cytoscape3.2.1 软件进行渲染，通过拓扑学参数筛选潜在核心靶点。

1.5 GO 富集分析

将从String 平台得到的相关蛋白上传至DAVID数据库进行GO（Gene Ontology）注释分析。GO 注释条目分析下又包括生物学过程（biological process，BP）、细胞学组分（cellular component，CC）以及分子功能（molecular function，MT），取每项条目下P值（-LOG10 P-Value）前十进行作图可视化。

2 结果

2.1 赤芍化学成分、作用靶点数据来源及标准化

通过TCMSP 数据库搜集到28 个符合OB≥30%、DL≥0.18 条件的化合物，这28 个化合物包括：鞣花酸（ellagic acid）、菠菜甾醇（spinasterol）、黄芩素（baicalein）、黄芩苷（baicalin）等，各个化合物的OB 值以及DL 值（Tab.1）。通过STD 数据库和SEA 数据库进行化学活性成分的靶点预测，得到442 个作用靶点，通过自由度值（degree）（平均自由度4.265，最大自由度 100）筛选得到赤芍活性成分-预测靶点核心网络图（Fig.1）。

Fig.1 Active ingredient-target core network diagram of Radix Paeoniae Rubra

Tab.1 Twenty-eight active compounds of Radix Paeoniae Rubra

continued

continued

continued

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2.2 肝癌相关靶点的获取及标准化

通过TTD、Drugbank 和OMIM 三个数据库搜集肝癌相关靶点，一共得到148 个疾病相关靶点，绘制肝癌-靶点网络图（Fig.2）。

Fig.2 Network diagram of liver cancer diseases-argets

2.3 靶点的映射

将上述预测的活性成分靶点及肝癌相关靶点通过Excel 进行映射，找到赤芍与肝癌作用的共同预测靶点23 个（Tab.2）。

Tab.2 Common target of Radix Paeonia lactifloraliver cancer

continued

2.4 PPI 网络构建

将上述获得的23 个共同预测靶点上传至String平台，获得蛋白-蛋白相互作用数据，以“tsv”格式保存。利用Cytoscape3.2.1 软件进行渲染，构建赤芍抗HCC 靶点网络，结果显示，与赤芍23 个靶点相互作用的蛋白有168 个，通过721 条边相互作用相互关联，绘制PPI 网络（Fig.3）。

Fig.3 PPI network

PPI 网络中，常常利用拓扑学指标中蛋白质节点的自由度值。某节点自由度值越大说明这个节点的蛋白越重要。运用Cytoscape3.2.1 软件中的“Network Analyzer”得到平均自由度值7.550 以及最大自由度值26，通过Degree 值筛选获得21 个核心靶点（Tab.3）。

Tab.3 The core target

continued

2.5 Gene Ontology（GO）功能富集分析

GO 注释得到561 条生物过程，主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的调控、ERK1 和ERK2 级联正向调节等；85 条细胞组分参与，包括细胞质、细胞质膜、核质等；130 条分子功能的信息包括蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性等。取各条目p 值前十做具体分析图（Fig.4）。

Fig.4 Gene Ontology（GO）functional enrichment analysis

3 讨论

原发性肝癌是我国第4 位常见的恶性肿瘤，其发病机制复杂，根据 GLOBOCAN 2018［12］，全球肝癌发病841 080 例，而中国肝癌发病 392 868 例，占 46.71%。有研究表明赤芍活性成分可对肝癌细胞的侵袭以及迁移有抑制作用［13］。赤芍中含有芍药苷、芍药醇、有机酸等活性成分，具有抗肿瘤等药理作用。本文通过运用网络药理学研究赤芍对抗肝癌的作用机制，为赤芍治疗肝癌提供了靶点、通路参考。

本研究通过TCMSP 筛选出赤芍的主要活性成分，并选取肝癌靶标进行预测作用分析，以探讨赤芍主要活性成分抗肝癌的潜在作用机制。对活性成分靶点的PPI 网络进行拓扑分析，得出21 个赤芍抗肝癌的核心靶点、561 条生物过程、85 个细胞组分、130 条分子功能。赤芍的核心作用靶点有CYP2C8、EGFR、EPHA2等，主要通过影响磷脂酰肌醇3-激酶信号转导的调控、肽基酪氨酸磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号传导等生物学过程和影响蛋白结合、肾上腺素受体结合、激酶活性等分子功能发挥抗肝癌作用。

根据赤芍、肝癌的共同靶点可以看出，有22 种成分对治疗肝癌具有高度活性，如芍药苷（paeoniflorin）、芍药苷酮（paeoniflorgenone）、鞣质酸（ellagic acid）、黄芩素（baicalein）、黄芩苷（baicalin）等。芍药苷已被证明可以在各种类型的人类癌症中发挥肿瘤抑制作用［14］，其抑制肝癌发生可能是通过促进细胞凋亡实现［15］。黄芩素对肝癌细胞的HepG2和SMMC-7721 均有抑增殖、促凋亡作用［16］。高剂量黄芩素能通过下调肝癌干细胞的诱捕受体3 表达而抑制细胞的一系列生物学行为［17］。黄芩苷对HepG2 细胞生长具有明显抑制作用且黄芩苷与放疗联合治疗对肝癌细胞的抑制有协同作用［18］，黄芩苷也可促进肝癌细胞Cx26 及Cx43 的表达，导致肝癌细胞GJIC 功能的恢复，这很可能是黄芩苷抑制肿瘤生长的分子机制之一［19］。

综上，本研究结果显示赤芍22 个活性成分作用于21 个核心靶点，并初步探究了赤芍对治疗HCC 的作用机制，为后续从赤芍中提取有效药物成分治疗HCC 提供了科学理论基础，也为论证中药复方的科学性提供了参考。由于中药成分的复杂以及现阶段对中药复方认识的局限，且基于药理学和生物信息学对赤芍的认识仍存在很多不足，因此，对赤芍治疗HCC 的作用机制研究仍需要进一步的药理学实验验证。