隐丹参酮及其羟丙基-β-环糊精包合物在大鼠体内的药动学研究

张冕 万芳 王勇 何文

摘要：目的：对大鼠灌胃给予抗肿瘤药物隐丹参酮及其羟丙基-β-环糊精包合物，建立药物含量的体内测定方法，并考察其在大鼠体内的药动学特征。方法：将大鼠随机分成两组，一组灌胃给药隐丹参酮原料药，一组灌胃给药隐丹参酮羟丙基-β-环糊精包合物，血浆样品经处理后采用高效液相色谱法测定药物浓度，以非诺贝特为内标，采用Hypersil ODS2-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm），甲醇-水（70：30）为流动相，流速为1.0mL·min-1，检测波长为254 nm，柱温25 ℃。血药浓度数据采用DAS软件进行处理并计算相关药动学参数。结果：隐丹参酮在大鼠体内Cmax、tmax、AUC0-t、AUC0-∞分别为2.85 μg·mL-1、2.27 h、19.69 mg·h·L-1、23.45 mg·h·L-1，隐丹参酮羟丙基-β-环糊精包合物在大鼠体内Cmax、tmax、AUC0-t、AUC0-∞分别为8.50 μg·mL-1、1.36 h、45.41 mg·h·L-1、61.66 mg·h·L-1。結论：该法可用于隐丹参酮及其包合物的体内含量测定，与隐丹参酮原料药相比，其包合物达峰时间提前，血药浓度的峰值增大，药-时曲线下面积增大，生物利用度提高。

关键词：抗肿瘤药物;隐丹参酮;羟丙基-β-环糊精;包合物;药动学

中图分类号：R969.1  文献标志码：A  文章编号：1008-4657（2020）02-0042-05

0 引言

隐丹参酮（cryptotanshinone，CT）是从药用鼠尾草植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）及甘西鼠尾草（S.przewaquskii Maxim）的根中分离提纯的二萜醌类化合物，具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗肥胖，改善脑缺血损伤、治疗多囊卵巢综合征等[1-3]。近年来研究表明，隐丹参酮可以通过抑制癌细胞的增殖、转移和侵袭，诱导癌细胞发生凋亡，抑制新血管和淋巴管生成和抗氧化等途径发挥抗癌作用，是一种很有前景的抗肿瘤药物[4-6]。然而隐丹参酮的水溶性较差，加上其对光极为敏感，会发生光化反应，限制了其临床应用。

羟丙基-β-环糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是β-环糊精的C2，C3和C6位羟基被羟丙基取代后生成的衍生物，具有增溶作用大、包合能力强、毒性小、提高药物稳定性的优点，甚至可以用于注射给药[7]。

本文在前期隐丹参酮制成HP-β-CD包合物，通过包合技术来改善药物的溶解性和稳定性的基础上，进一步将隐丹参酮及其包合物对大鼠进行灌胃给药，通过采用HPLC法考察隐丹参酮及其包合物在大鼠体内的药物动力学行为，为隐丹参酮及其包合物的临床应用提供理论和实践参考依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

AX205型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）;3K30高速冷冻离心机（德国Sigma公司）;WH-3微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）;DC150-1氮吹仪（杭州佑宁仪器有限公司）;伍丰LC-100高效液相色谱仪（上海伍丰液相色谱仪）。

1.2 试药

隐丹参酮标准品（纯度 ≥ 98%，阿拉丁化学试剂上海有限公司）;隐丹参酮原料药（纯度98%，西安开来生物工程有限公司）;隐丹参酮羟丙基-β-环糊精包合物（实验室自制，包合率约79%）;非诺贝特标准品（批号：100733-201502，中国食品药品检定研究院）;甲醇（色谱纯）;其它试剂为分析纯。

1.3 受试动物

SD大鼠12只，体重（250 ± 10） g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心，合格证号SCXK（鄂）2015-0018。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2-C18柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm）;流动相：甲醇-水（70：30）;流速：1.0 mL·min-1;检测波长：254 nm;柱温：25 ℃;进样量：20 μL。

2.2 标准品溶液及内标溶液的配制

2.2.1 标准品溶液的制备

精密称取隐丹参酮标准品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为0.20 mg·mL-1的溶液，作为标准品储备液。精密量取储备液适量，以甲醇为溶剂，定量稀稀释成浓度为1.00、2.00、5.00、15.00、25.00、50.00、75.00、100.00 μg·mL-1的对照品溶液，4 ℃保存，备用。

2.2.2 内标溶液的制备

精密称取内标物质非诺贝特标准品[8]5.0 mg于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度。取该溶液2 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得质量浓度为100.00 μg·mL-1的内标溶液，4 ℃保存，备用。

2.3 血浆样品的处理

将大鼠全血置于肝素钠抗凝处理过的离心管中，于高速冷冻离心机中12 000 r·min-1分离血浆，用微量进样器吸取200 μL上清液于离心管中，精密加入内标溶液50 μL，旋涡混合1 min，加入5 mL甲醇，旋涡混合3 min，于高速冷冻离心机中12 000 r·min-1离心10 min，分离上清液，于35 ℃水浴用氮气流吹干。残渣用100 μL流动相涡流溶解后，取20 μL上清液用“2.1”项下条件进样，记录色谱图。

2.4 方法学研究

2.4.1 专属性

取空白血浆、空白血浆+隐丹参酮、空白血浆+隐丹参酮+内标、受试大鼠灌胃给药后所采集的血浆，按“2.3”项下操作进行处理后，进样检测，分别记录色谱图，见图1。

  图1结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰隐丹参酮和内标非诺贝特的测定，隐丹参酮的保留时间为6.3 min，非诺贝特的保留时间为8.9 min。

2.4.2 标准曲线

取大鼠空白血浆200 μL，分别加入“2.2”项下不同浓度的隐丹参酮标准品溶液20 μL，摇匀，配成隐丹参酮质量浓度分别为的系列血浆样品，按“2.3”项下方法，自“精密加入内标溶液50 μL”起同样操作，进样分析，记录隐丹参酮的色谱峰面积（Ai）和内标非诺贝特的色谱峰面积（As）。以峰面积比R（R = Ai/As）为纵坐标，质量浓度C为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程为R=0.0091C+0.7468（r = 0.994 6）。结果表明隐丹参酮血浆浓度在1.00～100.00 μg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.4.3 精密度

取大鼠空白血浆200 μL，按“2.4.2”项下方法配制低、中、高浓度的血浆样品各5份（浓度分别为5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），按“2.3”项下操作进行血浆样品的处理，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别于日内测定5次，用隐丹参酮的峰面积与内标峰面积比R带入标准曲线中计算得到相应的浓度，进而计算样品的日内精密度。同样的方法，連续测定5 d，计算日间精密度。结果见表1，三种不同浓度隐丹参酮日内精密度的RSD为 2.78%～4.26%，日间精密度的RSD为5.88%～7.01%，均小于10%，符合体内生物样品分析要求[9]。

2.4.4 提取回收率

取大鼠空白血浆200 μL，按“2.4.2”项下方法配制低、中、高浓度的血浆样品各5份（浓度分别为5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），按“2.3”项下操作进行血浆样品的处理，按“2.1”项下色谱条件进行测定，将所得峰面积与相同浓度未经提取的隐丹参酮对照品溶液直接进样所得的峰面积相比[10]，得提取回收率分别为79.6%、82.3%、80.9%，RSD分别为8.6%、7.7%、7.9%。同法得内标提取率分别为74.9%、73.5%、70.6%，RSD分别为9.1%、7.8%、8.2%。结果表明，隐丹参酮对照品和内标通过该方法进行血浆样品处理后，提取回收率良好。

2.4.5 稳定性

2.4.5.1 室温放置稳定性

取大鼠空白血浆200 μL，按“2.4.2”项下方法配制低、中、高浓度的血浆样品各5份（浓度分别为5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），按“2.3”项下操作进行血浆样品的处理，分别于0，1，2，4，8，16，24 h进样，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录隐丹参酮和内标的峰面积，计算可得低、中、高浓度血浆样品的RSD分别为9.8%、8.4%、9.1%。结果表明，隐丹参酮血浆样品在24h内稳定。

2.4.5.2 反复冻融稳定性

取大鼠空白血浆200 μL，按“2.4.2”项下方法配制低、中、高浓度的血浆样品各5份（浓度分别为5.00，25.00，75.00 μg·mL-1），于- 20 ℃冷冻后，放置于室温状态下，待其完全融解后，按按“2.3”项下操作进行血浆样品的处理，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录隐丹参酮和内标的峰面积。将剩余样品再次于- 20 ℃冷冻后，重复上述操作，反复冻融3次，考察样品的反复冻融稳定性。计算可得低、中、高浓度血浆样品的RSD分别为8.3%、7.8%、9.2%，结果表明隐丹参酮血浆样品反复冻融3次稳定。

2.5 动物实验方案

将SD大鼠随机分成两组，雌雄各半。受试前大鼠禁食12 h，不禁水，灌胃给药5 h后进食。第1组灌胃给药隐丹参酮原料药，第2组灌胃给药隐丹参酮HP-β-CD包合物，其中隐丹参酮的给药量均为30.0 mg/kg。分别于给药前及给药后0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h从眼底静脉丛采血0.4～0.5mL，置于肝素钠抗凝处理过的试管中，分离血浆，置- 20 ℃保存待测。

2.6 药代动力学研究

根据测定的各时刻的血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线，见图2。

经DAS2.1.1药动学软件进行数据拟合，计算药动学参数，具体结果见表2。包合物的相对生物利用度计算方法如下式：F（%）=（AUC0-∞）包合物/（AUC0-∞）原药 × 100%[11]。由表中的数据可得，包合物组的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均高于单体组，而其tmax远小于单体组，表明将隐丹参酮制成包合物后，吸收速度明显加快，吸收程度显著增加。

3 讨论

本实验进行了大量预实验，最终选用非诺贝特为内标，建立了大鼠血浆中隐丹参酮的HPLC测定方法，该法操作简单、灵敏准确。在血药浓度的测定中，采用内标法能有效地消除实验条件变化等因素引起的误差，同时将血样进行氮气流吹干这一富集化操作，也能有效地提高检测的灵敏度。

隐丹参酮是一种很有前景的抗肿瘤药物，包合技术一方面能改善其水溶性较差的特点，另一方面能降低其光化反应的发生几率，增加其稳定性。本文采用HP-β-CD对隐丹参酮进行包合，测定隐丹参酮及隐丹参酮HP-β-CD包合物的血药浓度，考察其在大鼠体内的药动学特征，将所得药动学参数进行t检验，结果显示隐丹参酮HP-β-CD包合物组的峰浓度、吸收速率常数与隐丹参酮组相比有极显著性差异（P<0.01）），且包合物组的药时曲线下面积增大，达峰时间提前，表明HP-β-CD对隐丹参酮的包合作用使其生物利用度提高。这可能是由于包合作用使隐丹参酮的溶解度增加、稳定性增强，在浓度梯度加大的作用下，其透膜吸收的速度和程度均加大的原因。

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[责任编辑：许立群]