宫颈癌组织中miR-365、miR-135a-5p及STAT3的表达水平及意义

王亦如，杜二球

(1.浙江省温岭市中医院病理科，浙江 温岭 317500；2.台州市中心医院妇产科，浙江 台州 318000)

宫颈癌危害女性生殖健康的生殖道肿瘤之一，目前虽可通过筛查技术早发现，但其仍未得到很好控制，且发病率呈现年轻化趋势[1]。因此，探讨宫颈癌的发病机制对预防宫颈癌有重要意义。微小蛋白核糖核苷酸(miRNA)是一种长度较短的单链RNA，它能够通过结合miRNA的3′-端非编码区来调节靶基因的表达。miRNA在肿瘤细胞的生物学过程中发挥着重要作用，如调节肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等[2]，故分析不同miRNA在宫颈癌中的作用可为宫颈癌防治提供更多信息。研究显示宫颈癌中微小蛋白核糖核苷酸(microRNA，miR)-135a-5p的表达上调可影响信号转导与转录激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3、GATA结合蛋白3，进而参与宫颈癌的发生发展[3]。部分研究显示，miR-365作为抑癌基因，其过表达能减弱癌细胞的迁移和侵袭[4]，但其在宫颈癌中的研究较少。本研究探讨宫颈癌癌组织中miR-365、miR-135a-5p及STAT3的表达水平，以验证相关研究结论，并为宫颈癌诊治寻找新的切入点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集浙江省温岭市中医院2016年1月至2019年6月间收治的132例宫颈手术切除标本。纳入标准：①所有组织标本均病理诊断明确；②术前未接受放化疗、免疫治疗等任何抗癌治疗；③临床资料完整。排除标准：①研究对象合并其他恶性肿瘤者；②入组前接受其他宫颈治疗者。132例组织标本中宫颈癌75例(宫颈癌组)、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)30例(CIN组)、正常宫颈组织27例(对照组)。宫颈癌组：年龄33～65岁、平均年龄(48.37±8.04)岁。CIN组年龄30～62岁、平均年龄(47.47±8.96)岁。对照组年龄30～65岁、平均年龄(48.73±8.56)岁。三组年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 检测方法

1.2.1实时荧光定量聚合酶链式反应

取冻存的宫颈组织标本，溶解后使用Trizol试剂(Trizol RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司)从组织中提取总RNA，经紫外分光光度计测定RNA纯度与浓度，根据OD260/OD280比值估计，将符合浓度标准的RNA分装标记，-80℃保存；使用miRNA逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA(miRNA逆转录试剂盒购自日本Takara公司)，按照试剂盒说明配置聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)体系，使用实时PCR仪进行实时PCR(PCR试剂盒购自上海妍琦生物科技有限公司，实时PCR仪为美国ABI 7500型)。PCR扩增反应条件：95℃预变性2min、95℃变性10s、55℃退火30s，变性、退火39次。每个样品设置三次重复孔。miR-365、miR-135a-5p的引物由上海生工生物有限公司合成，均以U6作为内参反应体系，使用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量。

1.2.2免疫组化SP法

取4%多聚甲醛固定的宫颈组织块，常规石蜡包埋、4μm切片，石蜡切片置于烤箱中烤干，然后置入二甲苯中脱蜡、梯度酒精脱水，PBS 5min×2次清洗后在切片上滴加3%过氧化氢溶液去内源性过氧化物酶，PBS 5min×3次清洗，甩干后使用pH 6.0枸橼酸缓冲液进行抗原修复，PBS 5min×3次清洗，滴加血清工作液封闭10min后清干，滴加一抗(STAT3单克隆抗体，上海晶抗生物工程公司提供)，4℃冰箱孵育过夜后加入二抗，二氨基联苯显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、干燥后封片，光学显微镜下随机抽取10个高倍镜视野观察细胞染色情况。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.3 评估标准

STAT3以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，染色强度分为无着色、浅黄色、棕黄色和棕褐色，分别计分0～3分；阳性细胞数分为无阳性细胞、<10%、11%～50%、51%～75%、>75%，分别计分0～4分；总分=染色强度×阳性细胞占比得分，0～2分为阴性，≥3分为阳性[5]。

1.4 观察指标

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测各组miR-365、miR-135a-5p表达水平，采用免疫组化SP法检测各组STAT3表达水平，分析miR-365、miR-135a-5p及STAT3表达水平与宫颈癌临床病理特征间的关系。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组间miR-365、miR-135a-5p、STAT3表达水平

三组间miR-365相对表达量、miR-135a-5p相对表达量比较差异均具有统计学意义(均P<0.05)，进一步每两组间比较发现宫颈癌组miR-365相对表达量均显著低于CIN组和对照组(t值分别为2.788、3.457，均P<0.05)，而miR-135a-5p相对表达量均显著高于CIN组和对照组(t值分别为2.994、3.906，均P<0.05)。CIN组miR-365相对表达量显著低于对照组(t=2.753，P<0.05)，而miR-135a-5p相对表达量显著高于对照组(t=2.805，P<0.05)。此外，三组间宫颈组织中STAT3阳性率比较差异具有统计学意义(P<0.01)，进一步每两组间比较结果发现宫颈癌组织STAT3阳性率均显著高于CIN组和对照组(χ2值分别为10.647、71.889，均P<0.01)，而CIN组宫颈组织STAT3阳性率显著高于对照组(χ2=24.211，P<0.01)，见表2。

表2 各组间miR-365、miR-135a-5p、STAT3表达水平比较

2.2 各指标诊断宫颈癌的ROC曲线

ROC曲线显示miR-135a-5p、miR-365及STAT3诊断宫颈癌的AUC分别为0.862、0.747、0.644(均P<0.05)，STAT3敏感性最高，miR-365特异性最高，见表3及图1。

图1 各指标诊断宫颈癌的ROC曲线

2.3 miR-365、miR-135a-5p、STAT3与宫颈癌临床病理特征的关系

肿瘤直径≤5cm、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、有淋巴结转移者宫颈组织miR-365相对表达量较低(均P<0.05)，而miR-135a-5p相对表达量较高(均P<0.05)，差异均具有统计学意义。不同年龄、病理类型、分化程度、宫旁浸润患者miR-365、miR-135a-5p及STAT3表达水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，不同肿瘤大小、FIGO分期及有无淋巴结转移患者STAT3比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表4。

表3 各指标诊断宫颈癌的效能

表4 miR-365、miR-135a-5p、STAT3与宫颈癌临床病理特征的关系

3 讨论

3.1 miR-365、miR-135a-5p及STAT3与宫颈癌发生的关系

宫颈癌的发生主要与高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus，HPV)感染相关，少数患者经CIN最终发展为宫颈癌[6]。由CIN转变到宫颈癌的过程可长达十数年，这一转归是多因素、多步骤的过程。miRNA作为肿瘤生物学中的核心分子，其对基因表达的转录后调控已被证实是与多种生理、病理过程相关的关键调节方式[7]。因此，探讨miRNAs在宫颈癌发生机制中作用，对筛选高危人群和早期防治有明显积极意义。miR-135a-5p属于miR-135家族成员之一，有研究显示miR-135a-5p在宫颈癌组织中高表达，还可影响STAT、GTAT蛋白表达[8]，miR-135a-5p可能在促进宫颈癌发展中起重要作用。而STAT3与HPV感染、CIN进展均关系密切，还参与调节恶性肿瘤细胞周期、增殖与凋亡。除致癌基因外，抑癌基因负反馈减弱也是恶性肿瘤发生的重要机制之一。Chen等[9]学者的研究显示，miR-365过表达在体内外均显著抑制胆管癌生长，并促进癌细胞凋亡。故本研究探讨促癌基因miR-135a-5p和STAT3，抑癌基因miR-365在宫颈癌患者中的影响及其临床意义。

3.2 miR-365、miR-135a-5p及STAT3异常表达在宫颈癌发生中的作用

miR-135a-5p属于miR-135家族，有文献指出，miR-135a是调控肿瘤细胞侵袭抑制因子表达的重要基因，且会影响宫颈癌细胞的糖酵解和上皮-间充质转化[10]。本研究结果显示，miR-135a-5p在宫颈癌患者和CIN患者中相对表达量升高(P<0.05)，且宫颈癌患者miR-135a-5p相对表达量显著高于CIN组(P<0.05)，反映出miR-135a-5p可能参与宫颈癌形成。STAT3表达水平也表现出相近趋势，宫颈癌组STAT3阳性率明显高于其他两组(P<0.05)，与张少娟等[8]学者的研究结论相近。有研究显示丙肝病毒能通过增加miR-135a-5p表达，抑制其靶基因表达，间接促进STAT3表达[11]，这也说明STAT3与miR-135a-5p间存在相关性。而STAT3在高危型HPV感染者中表达增高，且高危HPV感染者可激活白介素-6/STAT3通路，通过肿瘤微环境中自分泌或旁分泌信号诱导肿瘤相关成纤维细胞的衰老，促进宫颈癌的发生发展。STAT3通路还在细胞周期调控和凋亡中起作用，机体正常状态下其激活相对快速且短暂，从而维持正常细胞生理功能，但其表达异常可持续性激活，经多种途径导致细胞异常增殖及恶性转化[12]。因此，miR-135a-5p过表达，可通过解除其靶分子对STAT3的抑制，来调控STAT3及其信号通路，参与宫颈癌发病过程。本研究通过绘制ROC曲线发现，miR-135a-5p诊断宫颈癌发病的AUC可达85%以上，STAT3诊断AUC也在60%以上，但STAT3诊断特异性略低，推测是由于部分CIN患者也表现出STAT阳性。但miR-135a-5p诊断宫颈癌发病敏感性可达90%以上，特异性也在65%以上，能较好地鉴别良恶性宫颈病变，最佳临界值为5.03。在宫颈癌病情进展中，miR-135a-5p也发挥一定作用。本研究结果显示，5cm肿瘤者、Ⅲ-Ⅳ期肿瘤者、有淋巴结转移者miR-135a-5p表达水平均更高(P<0.05)。

本组数据中，miR-365相对表达量在宫颈癌患者中显著下调。郭颖等[13]学者确定E74样受体4是miR-365在宫颈癌中的靶分子，miR-365表达下调，解除对其的抑制作用，从而促进宫颈癌细胞的增殖和肿瘤形成。MiR-365诊断宫颈癌发病AUC为0.747，其诊断敏感性和特异性均在70%以上，是实用性较高的一个诊断指标，最佳临界值0.94。在生物信息学预测和实验验证中，miR-365通过靶向抑制细胞周期蛋白和B淋巴细胞瘤-2来发挥作用，miR-365下调会影响正常细胞周期进程，促进恶性转变。同时，本研究也发现，miR-365在肿瘤直径更大者、中晚期肿瘤及有淋巴结转移者中表达水平更低(P<0.05)，说明下调miR-365也参与宫颈癌病情进展。由于本研究缺乏随访资料，因此未能评估miR-135a-5p、miR-365、STAT3与宫颈癌预后的关系，有待进一步研究。

综上所述，宫颈癌癌组织中miR-365下调、miR-135a-5p上调，STAT3表达水平高于正常组织，miR-365、miR-135a-5p均与宫颈癌患者肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移相关，miR-365、miR-135a-5p及STAT3是诊断宫颈癌的有效指标。