血清外泌体miR-148a联合miR-106a检测用于胃癌筛查的研究探讨

许超 曾劲韬 黄良祥 王弢 渠香云 董肇楠 贾云莉 马雪情 曾长青

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率居第5位，死亡率居第2位，严重威胁着人类健康［1］。由于胃癌发病隐匿，很多患者在确诊时已经处于胃癌进展期，预后较差［2］。因此，探寻胃癌早期诊断标志物及潜在的治疗靶点，对于降低患者死亡率、改善生存预后具有重要意义。Trams等［3］在20世纪80年代初发现外泌体，其在肿瘤的发生发展中起到重要作用［4-5］。外泌体包裹的miRNA具有更好的生物稳定性，目前已成为一类新的肿瘤生物标志物［6-7］。本研究旨在探寻合适的外泌体miRNA作为肿瘤生物标志物，辅助临床进行胃癌筛查。

首先，对于已有的文献、资料报道中胃癌相关的miRNA 标志物进行调研汇总，筛选出在胃癌研究中（上调和下调靶标）的miR-375/miR-106a/miR-148a/miR-21/Let-7a 作为候选标志物。然后采用qPCR 平台的外泌体miRNA 定量检测（SLEXO-PCR）技术，从候选标志物中筛选出了与胃癌发生、发展有较大相关性的外泌体miRNA鉴别诊断组合。

初步临床样本评价结果发现miR-106a、miR-148a、miR-375检测区分胃癌效果相对较好。采用组织样本对候选miRNA靶标检测验证。结果显示，miR-148a/miR-106a联合检测具有显著优势。进一步进行更大范围的组织学及血清外泌体检测进行验证。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取2017年9月至2018年9月在福建省立医院诊治的初诊胃癌术后标本共37 对（胃癌组织及癌旁组织）进行组织学miRNA 检测。选取初诊胃癌患者83例为胃癌组，选取同期在本院行胃镜检查，病理为良性病变的患者78例为对照组。对上述两组进行血清外泌体miRNA检测。

纳入标准：1）胃癌组：①均经内镜及手术病理确诊；②入院前均未接受任何肿瘤相关性手术、放化疗及其他肿瘤相关治疗；③无合并其他肿瘤；④无心、肝、肾等其他器官功能障碍者。2）对照组：①经胃镜检査，未见明显异常，病理为良性病变；②无胃部肿瘤或其他脏器肿瘤病史；③无心、肝、肾等其他器官功能障碍者。入选患者均知情同意。

排除标准：1）孕期及哺乳期患者；2）RNA类病毒感染者，如甲肝、丙肝、丁肝、戊肝肝炎病毒，流感病毒等。

1.2 方法

1.2.1 组织学检测 1）剪切组织，充分匀浆；每次使用前，剪刀酒精过火，DEPC 处理水洗4 次；剪切下1份组织之前，做同样处理；2）采用Trizol 法进行组织miRNA 提取；3）在NanoDrop 2000 上分析RNA 浓度、纯度；4）将组织miRNA浓度以50 ng/μL进行标准化；5）组织miRNA 检测（同血清外泌体miRNA 检测类似，不同的是组织miRNA 逆转录cDNA 产物浓度过高，需要统一稀释1 000倍后再进行检测）。

1.2.2 血清学检测 1）取外周血5 mL，分离血清；2）血清外泌体提取试剂盒（ExoQuick exosome precipitation solution）购自美国SBI公司。外泌体miRNA提取试剂盒（miRNeasy Mini Kit）购自德国Qiagen公司。胃癌外泌体miRNA（RT-qPCR）检测试剂盒购自江苏为真生物医药技术股份有限公司。3）用ExoQuick exosome pre⁃cipitation solution提取试剂盒提取血清外泌体待裂解。本研究通过透射电镜、Western blot和NTA对提取的血浆外泌体特性进行鉴定。在透射电镜下发现血清外泌体为一侧凹陷的半球形（图1）；CD81和Alix蛋白分别为定位于外泌体膜上和膜内的蛋白标志物，经Western blot曝光后成功显现（图2，3）；NTA示外泌体粒径约105 nm，浓度约4.3E+11（粒子/mL）（图4）。4）使用miRNeasy Mini Kit提取纯化RNA，NanoDrop 2000检测RNA浓度，记录浓度、A260/230、A260/280值。5）逆转录及qPCR上机检测（以miR-106a为例）：反转录反应体系为20 μL，包括2×miR-106a RTMix 10 μL，无核酸酶水8 μL，miRNA模板2 μL（循环参数：42℃，30 min；85℃，5 min；4℃，hold）。反应产物cDNA稀释10倍作为后续PCR反应模板。PCR体系为20 μL，包括2×miR-106a PCR Mix 10 μL，无核酸酶水8 μL，cDNA 模板2 μL（循环参数：37℃，5 min；94℃，5 min；94℃，15 s和60℃，60 s共50个循环；50℃，30 s）。

需注意的是所有miRNA标志物和GAPDH反应体系类似，逆转录热循环条件及PCR热循环条件相同，可同时同板进行逆转录和PCR检测。miR-106a的相关引物：（miRNA 序列标准品）has-miR-106a AAAAGUGC UUACAGUGCAGGUAG，（逆转录）Stem-Loop RT Primer：5'-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCAT CCTACCTG-3'，（PCR上游引物）Forward primer：5'-GAG GTCAGGGAAAAGTGCTTACAGTGCA-3'，（通用下游引物）Reverse primer：5'-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCA A-3'，（PCR探针）probe：5'-FAM-TTTCCTCATCCTAC CTG-MGB3'。miR-148a的相关引物：（miRNA序列标准品）has-miR-148a-3p UCAGUGCACUACAGAACU UUGU，（逆转录）Stem-Loop RT Primer：5'-GATGAGGA GTGTCGTGGAGTCGGCAATTTCCTCATCACAAAGT-3'，（PCR上游引物）Forward primer：5'-GAGGTCAGGGT CAGTGCACTACAGAAC-3'，（PCR探针）probe：5'-FAMTTTCCTCATCACAAAGT-MGB3'，（通用下游引物）Reve rse primer：5'-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'。

1.3 统计学分析

根据PCR上机数据获得GAPDH质控结果，判读样本质量是否符合要求。采用miRNA（miR-106a、miR-148a）标志物标准品梯度稀释检测，用以检测体系线性范围、定量限、检测下限及临床样本检测扩增效率评价。根据PCR上机数据获得miRNA（miR-106a、miR-148a）标志物的检测CP值和表达量（拷贝量/μL）。根据相对定量公式计算检测结果△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a），检测结果（相对定量）=2-△△CP。将检测结果与临床样本（病理诊断）对比统计分析，采用SPSS 17.0软件、MedCalc V15.2做出ROC曲线，得出cut-off值，计算符合率。计量资料比较采用t检验（用表示）或Mann-Whitney U检验［采用M（P25，P75）表示］，计数资料比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

图1 外泌体电镜观察

图2 外泌体特异性靶标分析（CD81）

2 结果

2.1 组织差异性检测结果

检测37 对胃癌组织及癌旁组织中miR-148a 和miR-106a的CP值和表达量、通过相对定量公式计算2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］。与癌旁组织相比，癌组织中miR-148a 表达水平降低，miR-106a 表达水平升高，联合检测2-△△CP值降低（均P<0.05，图5）。分别制作ROC曲线评价其对胃癌组织和癌旁组织的预测能力。基于miR-148a表达量的ROC曲线，AUC 为0.779（95%CI：0.659～0.898，P<0.001）（图6A）；基于miR-106a 表达量的ROC 曲线，AUC 为0.668（95%CI：0.545～0.791，P=0.013）（图6B）；基于2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC 曲线，AUC为0.869（95%CI：0.777～0.960，P<0.001）（图6C）。可见3 种检测指标均可以用来鉴别胃癌组织和癌旁组织，其中2-△△CP的ROC曲线下面积最大。

通过MedCalc V15.2进行3种检测指标的ROC曲线比较，提示miR-148a 和miR-106a 表达量的ROC 曲线下面积差异无统计学意义，miR-148a表达量和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲线下面积差异无统计学意义，miR-106a表达量和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲线下面积差异有统计学意义（P<0.01）。

图3 外泌体特异性靶标分析（Alix1）

图4 外泌体NTA分析

图5 组织学差异性散点图

2.2 血清外泌体差异性检测结果

检测83 例胃癌患者及78 例良性对照组血清外泌体中的miR-148a 和miR-106a 的CP 值和表达量、通过相对定量公式计算2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］。与对照组相比，胃癌患者中血清外泌体miR-106a 表达水平降低，联合检测2-△△CP值升高（均P<0.001，图7A、7B），而血清外泌体miR-148a表达水平两组差异无统计学意义（图7C）。分别制作ROC曲线评价其对胃癌患者和良性对照组的预测能力。基于miR-148a 表达量的ROC 曲线，AUC 为0.539（95%CI：0.448～0.629，P=0.395）（图8A）；基于miR-106a 表达量的ROC 曲线，AUC 为0.749（95%CI：0.673～0.825，P<0.001）（图8B）；基于2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC 曲线，AUC 为0.844（95%CI：0.782～0.905，P<0.001）（图8C）。提示血清外泌体miR-106a 和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］均可以用来鉴别胃癌患者和对照组，其中联合检查2-△△CP的ROC曲线下面积最大。而血清外泌体miR-148a 的ROC 曲线下面积在两组间差异无统计学意义，不能鉴别胃癌患者和对照组。

通过MedCalc V15.2进行血清外泌体miR-106a和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲线比较，miR-106a表达量和2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］的ROC曲线下面积差异具有统计学意义（P=0.024），提示血清外泌体miRNA联合检查优于单独检测血清外泌体miR-106a。

2.3 血清外泌体联合检测2-△△CP值与临床病理因素的关系

以2-△△CP值的cut-off 值作为分组指标，将全部161例资料以2-△△CP值的cut-off值（0.315 3）作为分组指标，分为2-△△CP高值组和2-△△CP低值组，对其临床基本数据进行分析。发现在年龄、性别、合并高血压、合并糖尿病、合并心血管疾病、吸烟、饮酒方面无显著性差异。表明上述因素对以联合检查2-△△CP值作为胃癌标志物的判断无影响（表1）。

以胃癌患者组中pT 分期（pT1～2、pT3～4）、pN分期（pN0～1、pN2～3）、肿瘤TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期），分化程度（中高分化、低分化）作为分组变量，肿瘤平均最大直径（5 cm），对2-△△CP值进行秩和检验。其中按pT分期分组，2-△△CP值具有显著性差异，其中pT3～4组2-△△CP值低于pT1～2，其余分组水平2-△△CP值均无显著性差异。而以pT 分期分组对血清外泌体miR-148a 和miR-106a 的表达量分别进行秩和检验，无显著性差异（表2）。

图6 组织学差异性ROC曲线图

图7 血清外泌体差异性散点图

图8 血清外泌体差异性ROC曲线图

表1 临床基本数据 例

表2 病理基本数据

3 讨论

本研究在组织学水平中发现，miR-148a 在胃癌组织中下调，miR-106a 在胃癌组织中上调，证明了miR-148a 和miR-106a 区分胃癌组织的潜力。Saka⁃moto 等［8］发现miR-148a 在胃癌中表达下调，靶向MMP7，提示肿瘤侵袭性和预后不良。Shi等［9］研究发现miR-148a 通过调节DNMT1 的表达来抑制DNMT1通过Akt-NF-κB 途径诱导抑癌基因的高甲基化，进而抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。Zhang 等［10］研究发现miR-148a 下调胃癌中TGF-β2 和Smad2 的表达，其中TGF-β 可作为致癌因子，参与增殖、血管生成、侵袭和转移，Smad2 的过度表达与胃癌的转移相关，并与胃癌预后不良有关，miR-148a 可作为胃癌治疗的潜在预测因子。Zhu等［11］研究发现miR-106a表达上调与胃癌转移和上皮间质转化有关，相关的研究［12-13］证实miR-106a 在胃癌组织中高表达，可能通过靶向Fas和TIMP，促进胃癌的发生发展。两种指标在癌组织和癌旁组织呈相反趋势改变，2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］值可加大两组的差异性，故鉴别癌组织和癌旁组织的ROC曲线下面积最大。

在血清外泌体水平，相比于对照组，miR-148a在胃癌组中有上调趋势（差异无统计学意义），Ren等［14］研究发现，miR-148a 在胃癌细胞的外泌体中有上调趋势；相对于对照组，miR-106a在胃癌组中有下调趋势。本研究结果与组织学水平的检查结果相反。Ohshima等［15］研究发现，胃癌细胞可将有抑癌作用的let-7 miRNAs 以外泌体的形式分泌到细胞外。故推测胃癌组外泌体中miR-148a 呈上升趋势，miR-106a呈下调趋势，可能是肿瘤细胞将有抑癌作用的miR-148a 以外泌体的形式分泌出去，而保留有致癌作用的miR-106a。两种指标在胃癌组和对照组呈相反趋势改变，2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］值可加大两组的差异性，故鉴别胃癌组和对照组的ROC 曲线下面积最大。

联合检查2-△△CP值在血清外泌体水平和组织学水平呈相反趋势，主要由计算因素导致。血清外泌体水平［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］为正值，组织学其为负值，经2-△△CP变化后，数据变化呈相反趋势。

临床和病理相关因素分析中，血清外泌体联合检查2-△△CP值与肿瘤pT 分期相关，但以pT 分期分组对血清外泌体miR-148a 和miR-106a 的表达量分别进行秩和检验，未发现显著性差异，表明2-△△CP值与肿瘤pT分期的关联可能无临床意义。

综上所述，本研究选取miR-148a及miR-106a进行组织学定量检测，分析两种miRNA在癌组织及癌旁组织表达的差异性，并进行血清外泌体检测，对比胃癌组与对照组血清外泌体miRNAs的差异，发现血清外泌体联合检测2-△△CP［△CP=CP（miR-148a）-CP（miR-106a）］值可以作为胃癌筛查的手段。