哺乳动物卵母细胞成熟相关因子研究

张羽芳　阳美霞　汤亚茹　张虹亮　王水莲

摘要：哺乳动物卵母细胞主要参与动物繁殖活动，其体外成熟技术也是体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的关键。卵母细胞从胚胎期至青春期前始终维持停滞状态，直到青春期减数分裂恢复，随后卵母细胞成熟。在此期间，表皮生长因子、马绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素、环磷酸腺苷、成熟促进因子及卵泡液等因子均参与卵母细胞成熟的调控。本文主要分析上述6种因子对卵母细胞成熟调控的影响，旨在完善卵母细胞成熟的相关理论机制，为卵母细胞体外成熟培养体系提供参考。

关键词：卵母细胞;成熟;表皮生长因子;人绒毛膜促性腺激素;成熟促进因子

中图分类号：R321                                 文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.14.007

文章编号：1006-1959（2020）14-0017-04

Study on Factors Related to Maturation of Mammalian Oocytes

ZHANG Yu-fang，YANG Mei-xia，TANG Ya-ru，ZHANG Hong-liang，WANG Shui-lian

（Department of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Abstract：Mammalian oocytes are mainly involved in animal reproduction activities， and their in vitro maturation technology is also the key to in vitro fertilization-embryo transfer （IVF-ET）. Oocytes remain stagnant from embryonic stage to pre-pubertal period， until meiosis in puberty recovers， and then the oocyte matures. During this period， factors such as epidermal growth factor， horse chorionic gonadotropin， human chorionic gonadotropin， cyclic adenosine monophosphate， maturation promoting factor， and follicular fluid are involved in the regulation of oocyte maturation. This article mainly analyzes the influence of the above six factors on the regulation of oocyte maturation， and aims to perfect the relevant theoretical mechanism of oocyte maturation， and provide a reference for the in vitro maturation culture system of oocytes.

Key words：Oocyte;Maturation;Epidermal growth factor;Human chorionic gonadotropin;Maturation promoting factor

近年來，随着辅助生殖技术、动物胚胎工程的蓬勃发展以及细胞克隆技术的广泛应用，卵母细胞体外成熟（Invitromaturation，IVM）的机理研究愈发重要。卵母细胞是哺乳动物最重要的配子之一，健康的卵母细胞是动物繁殖后代的关键。卵母细胞在进入青春期前停滞在第一次减数分裂中期，其中只有少数卵母细胞能够恢复减数分裂最终达到成熟，这一过程是依赖众多因子共同调控完成[1]。本文主要阐述影响卵母细胞成熟的因子功能及作用，旨在为揭示卵母细胞成熟机理提供思路，为更好挖掘优良母畜潜能以及推进良种家畜繁殖提供理论基础。

1卵母细胞成熟过程

卵母细胞成熟是一个复杂、动态的过程，包括细胞核和细胞质的成熟，如在培养基中添加葡萄糖可通过促进细胞核成熟从而提高早期胚胎发育[2];在培养基中添加大网膜提取物（Activated-omental extract，AOE）处理卵母细胞可促进其细胞质成熟从而提高成熟率[3];而添加糖酵解抑制剂可通过抑制细胞质成熟降低卵母细胞成熟率[4]。

1.1细胞核成熟  卵母细胞停滞在第一次减数分裂中期时，核染色质高度疏散，核形态呈泡状结构，被称为生发泡（Germinal vesicle，GV）。在促性腺激素的作用下细胞恢复减数分裂，核膜破裂，rRNA合成停止，核仁消失，细胞核致密化，生发泡破裂（Germinal vesicle break down，GVBD），排出第一极体随后停滞在第二次减数分裂中期。卵母细胞胞核成熟最为典型的特征是第一极体的排出[1]。

1.2细胞质成熟  细胞质成熟涉及细胞器、细胞骨架重组等变化。线粒体为卵母细胞成熟提供能量，在成熟卵母细胞内所占体积比重较大;线粒体向高能量消耗区域的移动对卵母细胞的成熟至关重要，如在小鼠体内，未成熟的卵母细胞的线粒体主要聚集在生发泡的周围，而生发泡破裂时线粒体移动并远离细胞核周围[5]。真核细胞包含三种主要的细胞骨架：微丝、中间丝和微管。细胞骨架是一种动态的、适应性强的结构，它可以根据细胞的需要保持不变或进行修饰，其中微管主要参与纺锤体的形成，而微丝参与形成皮质、建立极性等过程。在小鼠卵母细胞中，微管在GV期呈现相对均匀的分布，发生GVBD后，微管在染色体周围凝聚并开始向皮质迁移，而微丝在卵母细胞皮层下区域密集堆积[6]。研究证实在猪卵母细胞体外培养基中添加丙氨酸、β-巯基乙醇、亮氨酸和异亮氨酸均可通过提高细胞中谷胱甘肽（Glutathione，GSH）表达水平，从而促进后期胚胎发育，因此，GSH可作为卵母细胞胞质成熟的标志[7]。

2影响卵母细胞成熟的因子

2.1表皮生长因子  表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）是由53个氨基酸构成的多肽单链，其家族包括EGF和类EGF因子，它们具有高度相似的结构和功能，都可结合EGF受体（epidermal growth factorreceptor，EGFR）發挥其相关作用。EGFR是分子量为170 kDa的细胞膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶受体。类EGF因子包括双调蛋白（amphiregulin，AREG）、β细胞素（betacellulin，BTC）等11个蛋白质因子[8]。

EGF主要依赖LH来调控卵母细胞的成熟，LH通过作用壁层颗粒细胞的LH受体，激活壁层颗粒细胞EGF作用靶点，再将信号传递至卵丘颗粒细胞的EGF受体，从而发挥LH峰作用促进排卵的发生[9]。实验证实使用EGF处理体外培养牛卵母细胞，可显著提高其GVBD率，促进细胞核成熟，与透明质酸联合使用效果更为显著[10]。通过添加EGF培养不同规格的猪卵泡，证明EGF通过调节LH信号从而促进卵泡中卵母细胞核成熟、卵丘扩展及透明质酸的分泌，同时促进微丝F-actin重排[11]。类EGF因子同样影响卵母细胞成熟，EGFR的抑制剂AG1478可显著抑制AREG和促卵泡素FSH诱导的减数分裂恢复，并且EGF可通过旁分泌作用于卵丘颗粒细胞，提高卵丘扩展因子Ptgs2的表达水平从而促进卵丘扩展和卵母细胞成熟，且在卵丘颗粒细胞和排卵前卵泡中，类EGF因子也会瞬时诱导卵丘扩展因子（Has2、Ptx3、Tnfaip6、Ptgs2）mRNA表达水平升高，所以EGF常作为卵母细胞体外成熟培养体系的添加因子之一[9]。同时，EGF还可通过促进卵丘细胞的胞吞和自噬功能影响卵母细胞的成熟[12]。

EGF可多方面参与卵母细胞的调节，如促进核成熟、上调卵丘扩展因子水平，影响卵丘细胞胞吞、自噬，最终促进卵母细胞成熟。

2.2马绒毛膜促性腺激素  马绒毛膜促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）由怀孕母马的子宫内膜杯（子宫内膜表面围绕着着点的环状结构）分泌。PMSG是胎盘哺乳动物中糖基化程度最高的垂体糖蛋白[13]。PMSG常应用于哺乳动物的超数排卵。在进行小鼠卵母细胞实验时，为得到更多的细胞，往往会对雌性小鼠进行PMSG腹腔注射超数排卵。Ryabukha YA等[14]研究显示，通过在小鼠发情期腹腔注射10 IU的PMSG较发情间期可以显著提高GV期卵母细胞得到的数量。且发现PMSG注射组GV期细胞的卵泡和细胞质的直径明显低于其它卵母细胞，透明带的厚度和卵黄周隙也有同样的情况，表明PMSG对在发情周期获取更多优质细胞有着重要作用。PMSG除了超数排卵的作用外，还可促进小鼠卵泡发育，且PMSG较FSH半衰期长，低剂量PMSG即可等同于高剂量FSH作用，所以常使用PMSG代替FSH的使用[13]。

2.3人绒毛膜促性腺激素  在辅助生殖技术中，成熟激活是未成熟卵母细胞在受精前的最后分化过程。临床上常用人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）来激活卵母细胞成熟。hCG最早于1927年从孕妇的血液和尿液中分离得到，是由胎盘分泌的糖蛋白激素，与LH有类似作用可促进卵泡发育、卵母细胞的成熟排卵。且hCG的半衰期较LH长，短时间内不易降解，与受体的结合更为紧密，所以临床上通常使用hCG代替LH[15]。Saeedeh D等[16]证明hCG结合FSH可提高人卵母细胞成率。郭剑等[17]在成熟培养基中添加不同浓度的hCG培养小鼠卵母细胞，中、高浓度可明显提高优质胚胎率。邢雅欣等[18]的研究同郭剑的结果一致，在受精液和胚胎培养液中添加一定浓度的hCG可提高囊胚细胞数及调控胚胎质量相关基因的表达。同样曹筠青等[19]研究证实在猪卵母细胞体外成熟培养基中添加10 IU/ml的hCG对后续胚胎发育起到最佳的促进作用。hCG可促进卵母细胞GVBD，且主要影响卵母细胞发育为早期胚胎的能力。

2.4环磷酸腺苷  环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是参与生命活动的第二信使。在卵泡中，其来源有两种方式，一种是颗粒细胞通过缝隙连接传递给卵母细胞;第二种是通过G蛋白偶联受体激活胞内腺苷酸环化酶（adenylate cyclase， ADCY）。ADCY是一种能将三磷酸腺苷（ATP）转化为磷酸腺苷和焦磷酸盐的酶，可合成并产生高水平的cAMP，是维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键因素，使卵母细胞停滞在GV期。cAMP的降解是由卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs）内的环核苷酸磷酸二酯酶（PDE）激活而发生[20]。在卵母细胞中，cAMP在促性腺激素的促进下增加到峰值，随后在胞质胞核中浓度下降，从而导致生发泡破裂（GVBD）[21]。

细胞内高水平的cAMP通过激活cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）来维持卵母细胞在GV期的减数分裂停滞，而PKA又反过来维持细胞减数分裂周期的成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）的表达[20-22]。cAMP的过早减少会导致胞质胞核成熟不一致，影响后续发育潜能，如早期胚胎的形成。实验证实从青春期前的母猪得到的卵母细胞相对于成年母猪的卵母细胞其积累cAMP的能力较弱，导致后续囊胚率低于成年母猪[23]。同样在体外成熟培养体系中添加cAMP类似物双丁酰环腺苷（N6，2'-O-dibutyryladenosine 3′，5′-cyclicmonophosphate，dbcAMP）可促进由FSH诱导的卵丘扩展相关基因Has2、Tnfaip6和Ptgs2的表达，以及类EGF因子相关基因AREG和EREG的表达，即cAMP可通过调节EGF受体信号和卵母细胞卵丘缝隙连接信号交流，促进牛小腔卵泡中卵母细胞的发育能力[24]。所以环磷酸腺苷对卵母细胞的成熟及减数分裂有着决定性的作用。

2.5成熟促进因子  成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）是主要调控卵母细胞减数分裂恢复的促进因子。MPF的活性升高，可开启有丝分裂和减数分裂。MPF是一种异源二聚体蛋白激酶，由调节亚基细胞周期蛋白cyclinB和催化亞基细胞周期蛋白依赖性激酶p34cdc2组成。其活性主要由细胞质中的cyclinB在细胞周期中的不断活化和衰减来调节，且p34cdc2必须被特异性去磷酸化才能在过程中达到其活性状态[25]。现在研究者们通过使用抑制剂来研究MPF的功能与作用，这些抑制剂的抑制途径是通过干扰p34cdc2的磷酸化或者阻断其ATP结合点如脱氢亮氨酸（dehydroleuco-dine，DhL）、放线菌酮（cycloheximide，CHX）来实现。Suvá M等[26]分别使用CHX和DhL处理孤雌激活后的卵母细胞，发现CHX可通过抑制MPF活性而促进第二极体排出、提高原核形成率并且不影响胚胎发育。而DhL仅能促进第二极体排出，对原核形成无影响。所以MPF在卵母细胞孤雌激活后发育为胚胎过程中发挥重要作用。Baek JI等[27]研究显示，使用玻璃化冷冻卵子进行体外受精，应用MPF促进剂咖啡因，可以维持MPF的高活性，并提高受精卵的囊胚形成率和附植率，但不影响囊胚中的细胞数量。Li J等[28]研究表明，Cyclin B2可替代Cyclin B1来驱动MPF的激活和第一次减数分裂的恢复，而Cyclin B2可补偿CyclinB1在第二次减数分裂中期阻滞中的作用。哺乳动物的MPF活性常从GV期缓慢上升，在第一次减数分裂时达到峰值随后降低，直到第二次减数分裂中期再次达到峰值，其活性变化周期与细胞成熟密切相关[25]。生长抑制特异性基因6（growth arrest-specific gene，Gas6）干扰RNA处理卵母细胞可通过下调Cyclin B1蛋白表达从而抑制MPF活化，影响MPF变化周期[29]。在镉暴露小鼠卵母细胞中，镉可通过维持MPF高活性，使MPF变化周期紊乱，抑制第一极体的排出，无法完成减数分裂[30]。MPF对卵母细胞的影响主要集中在卵母细胞减数分裂恢复以及卵母细胞发育为早期胚胎的能力两个方面。

2.6卵泡液  卵泡液即卵泡中的液体，主要由血浆渗出物和来自壁层颗粒细胞和膜细胞的分泌产物组成，与COCs密切接触。卵泡液影响卵泡发育过程、卵子成熟和排卵，是卵母细胞发育的微环境，影响其受精及后续胚胎发育。同时卵泡液中还含有颗粒细胞和膜细胞分泌的活性产物，如卵母细胞成熟所必须的类固醇激素（雌激素和孕酮）、生长调节因子等。卵泡液的成分主要由激素、旁分泌和自分泌信号通路直接动态的调节，而机体本身的身体状况只能起间接作用[31]。

研究显示卵泡液中激素FSH可促进卵母细胞减数分裂恢复，从而影响其成熟率[32]。在猪卵母细胞的培养基中添加卵泡液可促进细胞成熟、降低多精入卵率从而提高体外受精率[33]。卵泡液中还含有积累在卵母细胞内的代谢物，可为卵母细胞的分化提供必要的细胞内物质，包括氨基酸、脂类、核苷酸和其他小分子[34]。处于正常周期的卵巢，卵泡液中高浓度的生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）能够促进卵母细胞核的成熟并有益于后续胚胎发育质量[35];同样卵泡液中的骨形成蛋白15（bone morphogenetic protein-15，BMP-15）呈现高浓度表达时，受精卵可发育为最佳形态的早期胚胎[36]。卵泡液在人类的研究越来越宽泛。卵泡液中成分通过促进胞质胞核成熟和提高早期胚胎发育能力影响卵母细胞成熟，所以在卵母细胞体外成熟培养体系中添加一定的卵泡液有利于细胞成熟。

3 总结

卵母细胞成熟是一个复杂、动态的过程，其中EGF、hCG、PMSG、MPF、cAMP、卵泡液均发挥重要作用，且各调节因子间存在相互联系，共同参与卵母细胞成熟的调控。各因子主要通过影响卵母细胞减数分裂恢复、细胞核及细胞质的成熟、卵母细胞发育为早期胚胎的能力等方面参与调控卵母细胞成熟。本文通过阐明影响卵母细胞成熟相关因子的作用及途径，旨在揭示卵母细胞成熟的机理，可为完善卵母细胞体外成熟培养体系提供一定的参考，最终为推动辅助生殖技术发展提供理论基础。

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收稿日期：2020-05-07;修回日期：2020-05-17

编辑/成森

基金项目：1.国家自然科学基金（编号：31672507）;2.湖南农业大学双一流建设项目（编号：SYL201802017）

作者简介：张羽芳（1993.12-），女，贵州铜仁人，硕士研究生，主要从事动物生殖调研究

通讯作者：张虹亮（1987.1-），男，河北沧州人，博士，硕士生导师，主要从事动物生殖与发育调控研究;王水莲（1973.10-），女，湖南长沙人，博士，博士生导师，教授，主要从事动物生殖调控研究