利用DNA-RNA嵌合体增强CRISPR-Cas12a的靶标特异性（2020.7.22 Plant Biotechnology Journal）

CRISPR-Cas12a是第二类（V型）用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统。Cas12a通过单链（cr）RNA与目标DNA螺旋结合，形成DNA-RNA杂交双链。Cas12a在功能上与CRISPR-Cas9形成互补，一直是一種备受关注的基因工程工具。与识别富含鸟嘌呤（G）序列的Cas9不同，Cas12a识别特定的富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列（TTTN或TTN），并能特异性地诱导DNA双链断裂。

2020年7月2日，Nucleic Acids Research在线发表了来自韩国研究者的题为“Enhancement of target specificity of CRISPR–Cas12a by using a chimeric DNA–RNA guide”的论文，研究人员对CRISPR-Cas12a系统进行改进，用DNA部分替代（cr）RNA，改变碱基对靶DNA的能量势，可以高效、特异性地诱导靶DNA序列突变。这种基于DNA-RNA嵌合体的CRISPR-Cas12a基因组编辑，减少了脱靶切割，从而提高了安全性，在基因突变引起的不治症的治疗应用上具有潜在的潜力。

CRISPR-Cas12a比CRISPR-Cas9对目标DNA与gRNA的错配更敏感;当错配引入时，其切割活性将被显著抑制。但是，在其他区域的错配仍然可能存在，只是目前无法检测到。用DNA取代（cr）RNA可以通过改变导向物与靶点之间的结合能来提高靶点特异性。此外，DNA在水溶液中比RNA更稳定，更容易应用于基因组编辑，更便于产品商业化。因此，在本研究中，作者试图用DNA来替换了CRISPR-Cas12a的部分gRNA，进而提高系统的准确性，并使传统CRISPR-Cas12a基因组编辑工具更加多样化。

基于已经构建好的CRISPR-Cas12a复合物中明确的gRNAs和氨基酸序列与特定DNA的结合，作者在5端，3端和特定区域筛选可以降低脱靶效率但是不降低靶向切割效率的（cr）RNA-DNA嵌合体。实验结果表明在5发卡端的DNA替换会降低发卡结构的改变，进而使Cas12a的活力提高。除了5发卡端，在目标序列的特殊区域内的DNA替换将降低靶向切割效率，这样表明Cas12a蛋白需要与特定区域的2-OH识别才能稳定（cr）RNA-DNA双链结构。

（cr）RNA-DNA嵌合体降低了杂交能量，提高了对错配的敏感性，大大提高了目标DNA的特异性。作者使用SpCas9-切口酶和嵌合（cr）RNA引导的Cas12a，解决了目标编辑效率低的问题。开发了一种高度靶向特异性的基因组编辑技术。