参苓白术散合麦门冬汤对染矽尘肺纤维化（肺脾两虚型）大鼠肺组织细胞HMGB1、PDGF的影响＊

黄 高，曹继刚，何光志，杨光勇，杨长福，王宽琴，陈 永

（1. 湖北中医药大学基础医学院 武汉 430065；2. 贵州中医药大学基础医学院 贵阳 550025）

矽肺(silicosis)是由于机体长期吸入含二氧化硅（SiO2）粉尘等物质而引起的以肺间质纤维化为主要特征的全身性疾病。矽肺是我国最常见的职业病之一，迄今仍缺乏有效的治疗手段。虽然目前对矽肺的发病机制的研究众多，但尚未完全探明，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在多个脏器炎性反应及纤维化过程中起到关键作用，成为目前医学研究的热点[1]。Zhang L等[2]利用原儿茶醛（PA）调节HMGB1/RAGE 途径来预防实验性肺纤维化过程中，研究发现PDGF 表达可通过减少HMGB1 的调节而降低，由此说明HMGB1 与PDGF 之间呈在密切关联。中医临床普遍认为，矽肺肺纤维化基本病机是本虚标实。本虚即正气虚,前期主要以脾肺气阴两虚为主，后期在脾肺气阴两虚基础上，表现为肾阳虚。标实是瘀血、痰浊阻滞肺络[3]。

本研究根据矽肺患者的病因病机，通过辨证论治，收集中医多年来治疗矽肺患者的临床资料，以及在贵州省中医院（贵州中医药大学第一附属医院）、贵州省职业病防治院（贵州省第三人民医院）已取得的临床效果发现，中医药防治矽肺或肺间质纤维化能缓解疾病症状、修复损伤、调节免疫、限制炎症、恢复肺功能、改善血液流变及延缓病情进展等。针对已诊治该病肺脾两虚型患者有效经验显示在选方用药时应多使用益肺健脾，祛痰活络药物，善用培土生金之法，其中人参、麦门冬、黄芪、白术、茯苓、山药、半夏、丹参等为常选药物，故选取参苓白术散合麦门冬汤加减方（人参、麦门冬、黄芪、白术、茯苓、白扁豆、薏苡仁、山药、砂仁、半夏、丹参、三七、甘草）高、中、低三种不同剂量，对染矽尘肺纤维化肺脾两虚大鼠动物模型进行治疗，观察各组实验动物肺组织细胞HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量及基因表达的变化，探讨HMGB1与PDGF 信号通路之间的关系，以期明确本方法在治疗矽肺肺纤维化过程中的作用机制是否与调控HMGB1、PDGF等因素有关。

1 材料与主要仪器

1.1 动物

健康SD 大鼠，SPF 级，体重220～230 g，雌雄各半，购自长沙市天勤生物技术有限公司[许可证号：SCXK（湘）2014-0011]，实验过程严格遵守国家《实验动物管理条例》和2006年科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》，符合中国伦理委员会相关动物研究指导原则。

1.2 试剂

本实验所用的中药由贵阳中医学院第一附属医院提供；醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33021207）；二氧化硅晶体标准品（Sigma，纯度99%，粒子直径为0.5～10 μm,并且80%在1～5 μm间）；北京百泰克生物技术有限公司提供的2×TaqPCR Master Mix（Lot：#P5103）、DNA Marker DL2000（Lot：#B021003018）；高纯总RNA 快速抽提试剂盒（生产批号：B012005018）；逆 转 录 试 剂 盒（THERMO,Lot：00365247）；Rat HMGB-1 Elisa kit（Andy gene, Lot:AD20180601）；Rat IL-6 Elisa kit（Andy gene, Lot:AD20180601）；Rat PDGF Elisa kit（Andy gene, Lot:AD20180806）；Rat K-RAS Elisa kit（Andy gene,Lot:AD20180806）；HE 染 色 试 剂 盒（Solarbio, Lot：NO.20160808）。

1.3 主要仪器

超微量全波长酶标仪（美国，Multisksn Go）；显微镜摄像CCD 照相系统（日本，DP73+standard1.6）；超高灵敏度化学发光成像系统ChemiDoc XRS+（美国，Bio-Rad）;C1000 Touch ™96 孔 快 速PCR 仪（美 国，Bio-Rad）;PowerPac™HC 高电流电泳仪（美国，Bio-Rad）；超低温冰箱（美国，Thermo Scientific Revco PLUS 新型-86℃）；低温高速离心机（德国，Hettich）；控温水浴摇床（美国，FORMA）。

2 方法

2.1 实验分组与给药

按照大黄煎液灌服脾虚造模法[4]和《实验动物学教程》（2009年1月第1 版）“矽肺动物模型”方法[5]，选用清洁级SD 大鼠57 只（造模死亡与确定模型成功9只），随机分为对照组和造模组。对照组每日1次生理盐水灌胃（1 g/mL，12 g/kg），造模组采用隔日饥饱失常加每日1 次大黄水煎液灌胃（大黄生药含量为1 g/mL，12 g/kg），脾虚证造模30 d。停止灌胃2 d后，各组大鼠10%水合氯醛麻醉，气管注入1 mL 各实验用液体，立即将大鼠头部抬起直至大鼠完全直立，让实验用液体在两肺均匀分布。对照组注入灭菌生理盐水，造模组给予50 mg/mL SiO2粉尘悬液，30 d 后。待造模成功，造模组随机分为肺脾两虚模型组、激素组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组，每组8只。激素组给予35%醋酸泼尼松溶液0.01 mL/g[6]，中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组每天分别给予0.01 mL/g（含生药7 g/kg）、0.01 mL/g（含生药14 g/kg）、0.01 mL/g（含生药28 g/kg）中药灌胃，每周7次[7]。对照组和染矽尘组给予等体积的生理盐水灌胃，各组动物于造模成功后30 d处死。

2.2 动物处理及标本采集

造模30 d 后，随机取模型组大鼠肺组织HE 染色。治疗组治疗结束后，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛（按0.0035 mL/g）麻醉，取大鼠肺组织-80℃储藏备用。

2.3 测试指标

2.3.1 HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS含量ELISA检测

(1) 标准品加样在酶标包被板（以下简称“板”）上选10个孔加标准品，并将其分为5组，每组加2个浓度相同标准品，每孔50 μL,浓度分别为：12 μg/L、8 μg/L、4 μg/L、2 μg/L、1 μg/L（HMGB-1）；120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L(IL-6)；36 ng/L、24 ng/L、12 ng/L、6 ng/L、3 ng/L(PDGF)；120 ng/L、80 ng/L、40 ng/L、20 ng/L、10 ng/L（K-RAS）。

(2) 加样设空白孔、检测品孔，在板上样品孔中加样品稀释液40 μL,再加检测品10 μL，摇匀。

(3) 温箱培育与清洗封板后，在37℃温箱培育35 min。倒掉液体，各孔加200 μL清洗液，放置半分钟后倒掉，反复5次。

(4) 加酶标剂除空白孔外，各孔加酶标剂50 μL。

(5) 重复温箱培育和清洗倒掉液体，各孔加200 μL清洗液，放置半分钟后倒掉，反复5次。

(6) 各孔显色各孔分别加显色剂A 和B各50 μL，摇匀，在37℃温箱中，避光温育15 min。

(7) 检测450 nm波长检测各孔吸光度（OD值）。

2.3.2 HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS RT-PCR检测

首先将待测肺组织样品从-80℃超低温冰箱取出，按高纯总RNA 抽提试剂盒要求进行抽提总RAN，在分光光度计上于280 nm 及260 nm 处测量吸光度。以总RAN 为模板通过Oligo（dT）18 为引物进行反转录合成cDNA。

HMGB1-Forward:5′-GATGACAAGCAGCCCTAT-3′,Reverse：5′-TCCATGCCAATTTACAAC-3′，扩 增 片段 长 度481 bp[8]；IL-6-Forward：5′-ATTTATGAACAGCGATGATGCAC-3′，Reverse：5′-CCAGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3′，扩增片段长度150bp[9]；PDGFForward：5′-TGTTCCCCTCGTCCGTCTGTC-3，Reverse：5′-CTGGAGTGGAGTCCTTCCTTTGCT-3′，扩 增 片 段长度139 bp[10]；K-ras-Forward：5′-TTCTTTGTGTATTTGCC-3′；Reverse：5′-GAGCCTGTTTCGTGTCT-3′，扩增片段长度159 bp[11]。GAPDH-Forward：5′-AAGGAGGCAAAGGACACCAA-3′；Reverse：5′-AATGGCCCCCTTCACAGTTA-3′，扩增片段长度203 bp[12]；引物序列由北京博迈德基因技术有限公司合成。

PCR 反应程序：变性95℃5 min，95℃35 sec，退火60℃35 sec，延 伸72℃35 sec，36 Cycle，温 育72℃15 min。采用PCR 检测各组肺组织中基因HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 表达影响。采用25 μL 反应体系，PCR 反应体系为：2×TaqPCR Master Mix:12.5 μL；cDNA 产物：1.5 μL；无菌水：9.5 μL，上下游引物各0.75 μL。扩增产物在1.3%琼脂糖凝胶上电泳，用Bio-RadQuantity One 软件对电泳条带进行扫描和光密度分析。

2.4 计算与统计学处理

ELISA 检测等到OD 值后，采用CurveExpert V1.4版计算各指标含量，计算HMGB-1 含量，方程名称为Logistic 模 型:y = a/(1 + be-cx)（Coefficient Data:a =1.20189620628E + 001；b =1.04590763476E + 001；c =8.82891298157E + 000）；计算IL-6 含量，方程名称为3rd degree Polynomial Fit:y = a + bx+cx2+dx3...（Coefficient Data:a =-1.03303179300E - 001；b =2.02756014563E +002；c =-2.57552278630E + 002；d =2.10792982106E +002）；计算PDGF 含量，方程名称为修正Hoerl模型:y=ab1/xxc（Coefficient Data:a =4.03090694111E + 001；b =9.97501311334E - 001；c =3.53171007068E - 001）；计算K-RAS 含量，方程名称为有理函数:y=(a+bx)/(1+cx + dx2)(Coefficient Data:a=-2.92185647887E + 001；b=7.35851897803E+003；c=8.95821668939E+001；d=-3.86914666422E+001）。

所有结果均以平均数标准差表示，用SPSS 21.0软件进行方差分析P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 确定染矽尘肺纤维化（肺脾两虚）模型建立

3.1.1 一般情况

染矽尘肺纤维化（肺脾两虚）模型建立后，正常对照组：大鼠形体正常，姿势舒展，反应敏捷，活动自如，毛发光泽，饮食良好，粪便成型，且干湿合适，体重增加，呼吸均匀；模型组：大鼠长期倦卧、精神萎靡、形体消瘦、反应迟缓、毛发暗淡无光泽，饮食量减少，大便稀溏量多，呼吸急促。经过各药物治疗后，治疗各组大鼠与模型组比较，症状均有相应改善，精神明显好转，体重增加，反应尚灵敏，毛发欠光泽，饮食量尚可，大便成形，呼吸稍匀称，伴有轻度咳喘。与对照组比较，肺脾两虚模型组大鼠体重减轻。各治疗组体重均较肺脾两虚模型组升高，但较对照组低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠体质量比较(±s, n = 8)

表1 各组大鼠体质量比较(±s, n = 8)

注：*与对照组比较P＜0.05，＃与肺脾两虚模型组比较P＜0.05

对照组肺脾两虚模型组激素组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组体质量/g 278±36.72＃204±22.54*236±28.37*＃247±19.63*＃232±21.32*＃227±27.65*＃

3.1.2 染矽尘肺纤维化（肺脾两虚）模型肺组织切片

染矽尘肺纤维化（肺脾两虚）模型建立后，随机选取正常对照组和肺脾两虚造模组，共4只大鼠[7]。分别取肺组织进行HE 染色，发现与对照组比较，肺脾两虚造模组大鼠肺组织中肺泡间隔、支气管管壁等处纤维成分显剧增多,并形成明显的矽结节，造模组大鼠肺组织可见肺间质出现大量炎性细胞浸润，淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等明显增多，胶原组织沉积，肺泡腔大小不均，肺泡壁变厚，纤维结缔组织增加，提示矽肺大鼠模型造模成功（见图1）。

图1 染矽尘大鼠肺组织中病理切片观察

表2 各组大鼠肺组织HMGB1、IL-6、PDGF、RAS含量变化(±s, n = 8)

表2 各组大鼠肺组织HMGB1、IL-6、PDGF、RAS含量变化(±s, n = 8)

注：*与对照组比较P＜0.05，＃与肺脾两虚模型组比较P＜0.05

对照组肺脾两虚模型组激素组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组HMGB1/μg·L-1 12.24±1.46＃55.16±6.87*IL-6/ng·L-1 113.77±13.38＃304.18±15.64*PDGF/ng·L-1 77.29±6.60＃123.68±11.95*K-RAS/ng·L-1 304.97±20.17＃404.19±29.35*18.28±2.14*＃156.10±12.62*＃96.02±7.63*＃348.32±32.25*＃18.12±1.98*＃155.39±14.50*＃92.58±8.42*＃345.75±32.96*＃19.03±2.23*＃161.53±13.86*＃98.68±6.71*＃364.84±30.40*＃387.35±31.77*＃28.02±3.72*＃210.16±12.95*＃111.52±10.18*＃

3.2 各组肺组织中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 蛋白含量变化

研究发现肺脾两虚模型组肺组织中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量明显高于对照组（P＜0.05）。经过激素或中药治疗后，治疗各组肺组织中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量明显低于染矽尘组（P＜0.05），但都低于对照组（P＜0.05）。数据分析表明，中药低剂量组肺组织中各项指标均高于其他各治疗组（P＜0.05）；激素组和中药中、高剂量组肺组织中HMGB1、IL-6 的含量无显著差异（P＜0.05）；中药高剂量组肺组织中PDGF 含量明显低于激素组和中药中剂量组（P＜0.05），而激素组和中药中剂量组之间无显著差异（P＜0.05）；中药中剂量组肺组织中K-RAS 含量明显高于激素组和中药高剂量组（P＜0.05），而激素组和中药高剂量组之间无显著差异（P＜0.05）。这说明经过激素和中药治疗后，药物对染矽尘大鼠肺组织中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS含量有降低作用，中药各组对降低染矽尘肺纤维化大鼠（肺脾两虚）肺组织HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS蛋白含量有一定效果，其中中药中剂量和中药高剂量组效果较好，见表2。

3.3 HMGB1、IL-6、PDGF、RAS基因表达检测

经过RT-PCR扩增，与对照组肺组织比较，发现肺脾两虚模型组、激素组、中药高、中、低剂量组肺组织HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA表达明显高于对照组（P＜0.05），肺脾两虚模型组肺组 织 HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、KRASmRNA表达明显高于其他各治疗组（P＞0.05）。在治疗组中，中药高剂量组HMGB1mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA 表达明显低于与其他各治疗组（P＞0.05），中药中剂量组与激素组之间无显著差异（P＞0.05）；中药高剂量IL-6mRNA 与激素组之间无显著差异（P＞0.05），但都低于中药中剂量组；中药低剂量组各指标表达均高于其他各治疗组（P＞0.05）。由此显示，经过激素和不同剂量中药治疗后，治疗药物对染矽尘肺纤维化（肺脾两虚）大鼠肺组织HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA 表达有一定抑制作用，但中药高剂量降低染矽尘大鼠肺组织HMGB1mRNA、IL-6mRNA、PDGFmRNA、K-RASmRNA表达较明显，具体结果见图2、表3。

图2 RT-PCR扩增各组大鼠HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS基因产物琼脂糖凝胶电泳

表3 各组大鼠肺组织HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS基因表达变化(±s, n = 8)

表3 各组大鼠肺组织HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS基因表达变化(±s, n = 8)

注：*与对照组比较P＜0.05，＃与肺脾两虚模型组比较P＜0.05

K-RAS 11.114±0.93＃36.62±1.06*20.57±0.65*＃17.33±0.78*＃20.09±0.47*＃24.99±0.90*＃对照组肺脾两虚模型组激素组中药高剂量组中药中剂量组中药低剂量组HMGB117.04±0.94＃40.44±1.29*28.61±1.06*＃25.96±0.90*＃28.70±1.09*＃34.37±1.11*＃IL-628.45±1.17＃54.04±1.30*38.76±1.03*＃38.31±1.14*＃42.38±0.51*＃46.60±0.80*＃PDGF 20.13±0.79＃41.97±1.04*27.18±0.77*＃24.67±0.62*＃27.05±0.44*＃33.82±0.98*＃

4 讨论

本研究采用脾虚模型和矽肺肺纤维化模型相结合，模拟染矽尘肺纤维化早中期肺脾气阴两虚证型。结合《内经》中“皆聚于胃，关于肺”和《难经·六十九难》中“虚则补其母”等中医基础理论与临床实验经验，遴选中医培土生金法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”为基础方，加入活血药物组成。其中“参苓白术散”源于《古今医鉴》，功用为益气健脾，和胃渗湿，保肺(培土生金)。“麦门冬汤”源于《金匮要略》，功用为清养肺胃，降逆下气。两方合用健脾保肺，生津敛阴，治脾虚久咳肺虚，气阴两伤。两方中以人参、白术、茯苓、甘草(即四君子汤)平补脾胃之气，为主药。以白扁豆、薏苡仁、山药之甘淡，助白术既可健脾，又可补肺渗湿化痰，为辅药。以砂仁芳香醒脾，促中州运化，通上下气机为佐药。桔梗为太阴肺经的引经药，其作用如舟车载药上行，达上焦以益肺气。麦门冬甘寒养阴清热，润肺生津；半夏降逆化痰；加用黄芪补脾益肺，丹参、三七活血、凉血、安神；此方应用培土生金之法，对肺脾气阴两虚，久咳痰多者，效果较好。陈茂刚[13]运用参苓白术散治疗肺纤维化（肺脾气虚型）患者，能改善症状、增强机体免疫功能、有效抑制机体炎症反应。孙杰等[14]应用参苓白术散治疗慢性阻塞性肺疾病（肺脾两虚型）模型大鼠能显剧下调血清IL-1等炎症因子水平。刘建军等[15]发现，麦门冬汤能抑制放射性肺纤维化大鼠肺组织IL-1 和NF-KB 蛋白表达等。由此探讨参苓白术散合麦门冬汤对染矽尘肺纤维化（肺脾两虚型）大鼠肺组织细胞HMGB1、PDGF 的影响。采用大黄煎液灌服脾虚造模法，可能会出现大黄中、大黄素等成分通过血液吸收对肺纤维化形成有一定影响，但朱曼[4]、张伟[16]等前期脾虚复合肺纤维化模型显示大黄所含成分对肺纤维化的形成无影响。

HMGB1 是存在于哺乳动物细胞核中的一类非组蛋白，其可作用靶细胞表面受体，激活相关信号通路，刺激大量炎性因子的释放，放大和延长炎症反应,从而促进纤维细胞的增生、胶原沉积以及纤维结节的形成[11]。HMGB1能刺激巨噬细胞等单核细胞分泌的IL-6[17-18]，HMGB1 含量越多，单核细胞分泌IL-6 的量就越多。肺组织中血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞均可产生PDGF。研究表明，PDGF 与其受体结合后，导致该受体的胞内酪氨酸产生自主磷酸化，磷酸化酪氨酸与胞膜上的PDGF 受体结合蛋白2（Grb2）相结合，Grb2 又与鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS结合，参与激活Ras，引起成纤维细胞增生[19]。本研究发现，染矽尘肺纤维化肺脾两虚大鼠肺组织中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS含量明显升高，通过不同含量中药治疗后，大鼠肺组织中HMGB1、IL-6、PDGF、K-RAS 含量明显下降，既证明中药的效果，中药有下调这些蛋白的作用，又说明HMGB1与PDGF 之间存在正相关关系。

本研究遴选中医培土生金法的代表方“参苓白术散”合“麦门冬汤”加减灌胃治疗染矽尘肺纤维化肺脾两虚型大鼠，对对照组、肺脾两虚模型组、激素组和中药治疗各组大鼠治疗前后大鼠肺组织HMGB1、IL-6、PDGF、K-Ras 蛋白含量，基因表达水平作用的影响改变，从证候实质研究角度，既揭示PDGF/Ras 信号转导通路过度激活是染矽尘大鼠肺纤维化形成的主要机制，又提示HMGB1 可能激活PDGF/Ras 信号转导通路，促进肺纤维化的发生发展。本研究利用中医培土生金法能起到抑制矽肺肺纤维化（肺脾两虚型）HMGB1/PDGF/Ras 信号转导通路的作用，为优化中医药防治该疾病提供思路，又验证了中医五行相生理论“培土生金法”对中医临床与科研的指导意义。