矿泉水中产气荚膜梭菌检测能力验证经验

□ 徐万丽 深圳市通量检测科技有限公司

1 矿泉水中产气荚膜梭菌能力验证遇到的问题和解决方法

2019 年9 月份参加矿泉水中产气荚膜梭菌能力验证中遇到的问题：滤膜无黑色菌落产生，只有少量灰色和大量白色杂菌生长。由于大量杂菌存在，导致确证试验中生化现象不明显，最终实验结果没有通过。

2019 年12 月份再次参加产气荚膜梭菌测量审核，综合研究GB 4789.13—2012 和GB 8538—2016 及 各方资料[1—2]，制定以下实验方案。

按照测量审核作业指导书，先把冻干粉水化得到的原液，然后进行10倍和100 倍稀释，得到稀释液，对原液、稀释液进行检测。

方法1，取50 mL 样液用0.45 μm滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS 平板上，抽滤，做1 个平板。

方法2，取50 mL 样液用0.22 μm滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS 平板上，抽滤，共2 个平板。

方法3，取50 mL 样液用0.22 μm滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS 平板上，再覆盖一层SPS 培养基，抽滤，做1 个平板。

方法4，取50 mL 样液用0.22 μm膜抽滤，然后将滤膜反贴在SPS 平板上，即抽滤面朝下，抽滤，做1 个平板。

方法5，取50mL 样液用0.22μm膜抽滤，然后将滤膜正贴在TSC 平板上，抽滤，做1 个平板。

同时做阴阳性对照，将以上平板在（36±1）℃下厌氧培养24 h，结果如表1 所示。

验证试验，挑取各种形态不同的菌落做生化检验，验证试验结果：

所有菌落都可以在FTG 旺盛生长；透明白色的菌落生化指标都不符合；灰色和黑色菌落中有部分菌的生化指标全部符合，也有部分菌的生化指标部分符合，可能是杂菌太多，挑取菌落时带有杂菌。

表1 不同实验方法的实验结果

结果报告：参考实验中方法2 的灰色菌落（136、146 灰）和方法5 的黑色菌落数（173 黑）的数据，报了140 CFU/50 mL，通过了验证。

2 结果分析

从方法1 和方法5 对比看，用TSC平板贴滤膜更容易长出黑色菌落，更容易识别目标菌。这是因为TSC 培养基中柠檬酸铁铵和亚硫酸钠的含量比SPS 高，产气荚膜梭菌可以还原亚硫酸盐为硫醚，硫醚可以与柠檬酸铁铵反应呈黑色。增加亚硫酸盐的量和柠檬酸铁铵的量，可以增强黑色[3]。

方法5 中黑色菌落在空气中暴露一段时间，颜色变浅，是因为产气荚膜梭菌能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐和铁盐的琼脂中形成黑色菌落，遇空气后被氧化，黑色渐渐变成灰色，所以培养后要尽快计数和验证。

从10 倍稀释液的结果看，方法1的结果是16 个灰色菌落，方法2 平均为18 灰色菌落，结果相差不大，因此，0.45 μm 的滤膜和022 μm 的滤膜都可以用。

方法3 和方法4 中，覆盖一层SPS 培养基和滤膜反贴也能长出黑色菌落。覆盖一层长出菌落较少，反贴滤膜不利于后续挑取菌落。

SPS 和TSC 上都易有较多杂菌生长（TSC 相对少点），且FTG 是非选择性增菌肉汤。所以，杂菌较多时，可先把可疑菌分离纯化到TSC 平板上，再将单菌落接到FTG 中，最后进行生化试验。