消乳散结汤单药对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药性影响的初步研究

李晓梅, 宋金艳, 陈 芳, 徐 林, 李天禹, 罗 清

乳腺癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一[1]。化疗治疗乳腺癌能够有效减少患者复发率与死亡率，但长期应用易产生多药耐性(multidrug resistance，MDR)[2]。克服化疗药物耐药性是治疗乳腺癌需解决的难点与关键。针对这一难题，研究人员从多个角度进行了有益探索，其中，从天然药物中寻找高效、低毒、作用靶点广泛的肿瘤 MDR 逆转剂己成为目前临床研究的重点[3]。

传统中医药具有安全、价廉、毒副作用小等优点。中医或中西医结合的治疗手段贯穿乳腺癌治疗的整个历程，并且发现这些方法在逆转肿瘤MDR方面作用不可忽视[4-5]。消乳散结汤是李天禹教授[6]根据多年临床经验结合贵州本地的中药特点创制的经验方，对乳腺癌辅助治疗具有很好的疗效。通过查阅相关文献，该研究筛选出消乳散结汤方剂中具有抑制肿瘤生长，但在逆转乳腺癌MDR方面无相关文献报道的有效单体，分别为熟地黄、白芍、栀子、半枝莲以及浙贝母五味候选单药。随后，对五种候选单药在逆转乳腺癌MDR方面进行了初步的探索，以期寻找具有MDR逆转作用的药物，为临床治疗MDR乳腺癌提供理论依据及新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株与中药本实验中使用的人乳腺癌细胞敏感株MCF-7由遵义医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究室提供，人乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR购于上海银紫晶生物科技有限公司；MCF-7和MCF-7/ADR两种细胞均用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基，于5% CO2、37 ℃条件下进行培养。消乳散结汤中的五种单药白芍、栀子、浙贝母、半枝莲以及熟地黄均由遵义医科大学附属医院中药局提供，并由遵义医科大学附属医院中医科王刚老师进行鉴定。各单药均用常规水煎煮，经过滤、超滤除去杂质和细菌后，在无菌环境下将药液浓缩制备成冻干粉，然后将其用PBS配制成1 mg/ml的贮存液备用。

1.2 实验试剂与仪器阿霉素(adriacin, ADR)(深圳万乐药业有限公司)和MTT(美国Sigma-Aldrich公司)用PBS(pH =7.4)分别配制成1 mg/ml和5 mg/ml的贮存液。所有贮存液于0.22 μm滤器过滤除菌后，-20 ℃避光保存。胎牛血清(上海生工生物工程股份有限公司); RPMI 1640完全培养基(美国Hyclon公司); 倒置显微镜CKX41(日本OlymPus公司); 多功能酶标仪318(上海三科仪器有限公司); CO2培养箱FormaTMⅡ3111(美国Thermo公司); 双蒸水制备系统(美国MilliPore公司)。

1.3 ADR处理下MCF-7敏感株IC50的检测实验设置空白组、亲本组和不同浓度ADR组(1、2、4、8、16、32 μg/ml)。第1天取增殖旺盛的对数生长期MCF-7细胞，用0.25%的胰酶消化后轻轻吹打制备成单细胞悬液。亲本组和ADR组以每孔100 μl体积、5×103个细胞密度接种于96孔板，37 ℃、5% CO2，饱和湿度培养过夜。第2天吸弃两组旧培养基，新增空白组，并在空白组和亲本组中每孔加入100 μl新的RPMI 1640完全培养基，ADR组则每孔加入100 μl稀释到相应浓度ADR的RPMI 1640完全培养基。3组均继续培养48 h后每孔加入20 μl MTT贮存液，再培养4 h后弃上清液,每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO),避光振荡10 min,酶标仪检测492 nm波长处吸光值(OD值)。采用以下公式计算：ADR对MCF-7细胞的抑制率，并计算IC50值：细胞生长抑制率(%)=(亲本组OD值-实验组OD值)/(亲本组OD值-空白组OD值)×100%。

1.4 ADR处理下MCF-7/ADR细胞IC50的检测与耐药倍数的计算实验设置空白组、亲本组、ADR组(6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml)，每组6个复孔。同样采用MTT增殖实验法检测并计算MCF-7/ADR细胞的IC50值，具体方法参照1.3。采用以下公式计算MCF-7/ADR耐药倍数：细胞耐药倍数=耐药细胞株IC50/敏感细胞株IC50。

1.5 消乳散结汤各候选单药对MCF-7/ADR细胞无毒剂量的检测实验设置空白组、亲本组、候选单药组(0.001%、0.01%、0.1%、1%、10%贮存液浓度)，每组6个复孔。实验方法同1.3，计算各候选单药对MCF-7/ADR细胞IC10。

1.6 无毒剂量下对各候选单药逆转MCF-7/ADR细胞耐药作用检测实验分为空白组、ADR单独处理组、单药(浓度依据1.5项所测IC10选取 )+ADR组(6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml)。测量各候选单药联合不同浓度ADR组处理下MCF-7/ADR细胞IC50，按照以下公式分别计算逆转倍数及逆转率。逆转倍数=ADR单独处理组IC50/(ADR+单药联合处理组)IC50；逆转率=[ADR单独处理组IC50-(ADR+单药联合处理组)IC50]/ADR单独处理组IC50×100%。上述每组实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 MCF-7细胞和MCF-7/ADR细胞的形态学观察MCF-7与MCF-7/ADR细胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基进行培养。MCF-7细胞贴壁生长，边界清楚，呈多边形，如图1A所示。MCF-7/ADR细胞呈贴壁生长状态，边界较MCF-7细胞模糊，如图1B所示。

2.2 MCF-7/ADR细胞耐药倍数的检测以4 μg/ml ADR处理MCF-7细胞48 h后，MCF-7细胞状态明显变差，细胞由多边形变为圆形，大量细胞从贴壁状态变为非贴壁状态，漂浮于培养基中，如图1C所示；以40 μg/ml ADR作用于MCF-7/ADR细胞48 h后，MCF-7/ADR细胞形态稍变化，体积较未加ADR的亲本细胞稍变小，如图1D所示。

图1 ADR作用前后MCF-7与MCF-7/ADR细胞形态 ×100

利用MTT增殖实验检测不同浓度ADR对两种细胞存活率的影响，绘制出相应细胞的生长抑制率曲线。结果如图2所示，随着ADR浓度的增高，MCF-7和MCF-7/ADR细胞的生长受到明显抑制，当ADR浓度达到一定剂量时对细胞生长的抑制趋势逐渐趋于平缓。根据相应公式计算出MCF-7细胞的IC50为(2.88±0.31) μg/ml，MCF-7/ADR细胞的IC50为(115.05±2.45) μg/ml，耐药倍数为47倍。

2.3 消乳散结汤中各候选单药对MCF-7/ADR无毒剂量测定各候选单药在0.001%～10%浓度范围内对MCF-7/ADR细胞生长的影响，结果如表1所示，在0.001%～1%浓度下，消乳散结汤单药栀子、白芍、半枝莲、熟地黄、浙贝母对MCF-7/ADR细胞抑制率在±0.5%之间，对细胞生长无明显影响，不具有毒害作用。因此，选取对细胞无毒性的低剂量(1 μg/ml)和高剂量(10 μg/ml)两个浓度进行后续实验。

图2 不同浓度ADR对MCF-7和MCF-7/ADR细胞的生长抑制作用

2.4 消乳散结汤中各候选单药对MCF-7/ADR细胞耐药逆转作用的检测与ADR单独作用的标准组相比，单药浙贝母联合ADR作用于MCF-7/ADR细胞，其ADR的IC50工作浓度明显下降，在无毒剂量下选择的中药低剂量组与高剂量组耐药逆转倍数分别为1.16与1.23，逆转率分别为13.71%、18.77%，差异有统计学意义(P<0.05)，表明在选取的无毒剂量作用下，浙贝母与ADR联用时，对耐药株MCF7/ADR具有明显的耐药逆转作用。

表1 各候选单药对MCF-7/ADR细胞的生长抑制率(%)

而消乳散结汤中其他四味单药白芍、栀子、熟地黄、半枝莲，经联合ADR后作用于MCF-7/ADR细胞，与ADR单独作用相比，耐药的逆转倍数和逆转率相近，差异均无统计学意义(P>0.05)，表明在选取的无毒剂量作用下，这几位中药与ADR的联用，对耐药株MCF7/ADR不具有耐药逆转作用，见表2、图3。

图3 高低剂量浙贝母联合不同浓度ADR对MCF-7/ADR细胞生长抑制率

表2 单药联合ADR作用于MCF-7/ADR细胞的

3 讨论

尽管乳腺癌治疗取得了长足的进步，但乳腺癌患者的死亡率却呈逐年上升趋势，MDR是其主要原因之一。因此，逆转乳腺癌细胞MDR是治疗乳腺癌的新方向、新热点，也是目前所面临的最大挑战。ADR作为化疗的一线用药，已广泛应用于各种化疗方案治疗乳腺癌，但长期应用可能增加耐药性，导致治疗失败[7]。越来越多的研究表明，生物活性天然产物可作为化疗增敏剂，在逆转MDR方面具有疗效，Zhou et al[8]研究认为，苦参碱可通过PI3K / AKT信号通路逆转乳腺癌MCF-7 / ADR细胞的MDR。因此，中医药耐药逆转剂具有开发潜力和研究价值，并有可能成为新型抗癌剂。在本研究中，消乳散结汤是根据遵义医科大学附属医院李天禹教授多年治疗乳腺癌临床经验总结得出的经验方，对乳腺癌患者的治疗具有一定疗效，故本实验主要对此经验方进行单药分析，来研究消乳散结汤中栀子、白芍、半枝莲、熟地黄以及浙贝母五种单药对乳腺癌MCF-7 / ADR细胞耐药逆转方面作用，以期发现具有耐药逆转作用的单药为乳腺癌耐药治疗提供方向。

熟地黄[9]、白芍[10]、栀子[11]、半枝莲[12]以及浙贝母[13]都有抗癌药理活性。培米宁(PMI)是从浙贝母中提取的一种具有生物活性的成分。Tang et al[14]认为，与ADR组相比，PMI联合ADR可通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡来提高胃癌化疗中对ADR的药物敏感性。为探讨熟地黄、白芍、栀子、半枝莲以及浙贝母四种单药对MCF-7/ADR细胞的耐药性影响，本研究选取各单药对MCF-7/ADR细胞的无毒剂量，比较四种单药分别联合ADR干预MCF-7/ADR细胞与ADR单独干预MCF-7/ADR细胞情况。结果显示，与ADR单独作用相比，单药熟地黄、白芍、栀子和半枝莲分别联合ADR干预MCF-7/ADR细胞的IC50，差异无统计学意义(P>0.05)。然而，单药浙贝母联合ADR干预MCF-7/ADR细胞，细胞生长明显受限，差异有统计学意义(P<0.05)，表明浙贝母可增强MCF-7/ADR细胞对ADR的敏感性，具有MDR逆转作用。此结果与Tang et al[14]研究结果具有一致性。进一步研究结果显示，在一定范围内浙贝母联合高剂量ADR组更能促进乳腺癌细胞凋亡，说明了其耐药逆转能力具有剂量相关性。本课题组将在此研究的基础上，继续深入研究浙贝母对耐药逆转的作用以及相关机制，为乳腺癌耐药患者的治疗提供新的思路。