几株伪狂犬病病毒的增殖特性与保存条件

陈赛赛 郑亚婷 郭容利

摘要：高滴度的抗原是制备优质疫苗的首要条件。對6株伪狂犬病病毒在仓鼠肾（baby hamster kidney，简称BHK）细胞和猪睾丸细胞（swine testicular，简称ST）细胞上的增殖效率进行了比较，同时测定不同保存温度和冻融条件对病毒滴度的影响。结果表明，几株伪狂犬病病毒在BHK细胞和ST细胞上增殖效率均很高，可达到生产要求。相较于ST细胞，各毒株在BHK细胞上出现病变时间更早。然而，所有毒株在ST细胞上的病毒滴度都高于同期在BHK细胞上的滴度。强毒株AH02LA株在2种细胞上滴度可达108.0 TCID50/0.1 mL以上，表现为发生病变早，病毒增殖快，峰值到来早的特性。通过强毒株AH02LA株获得的基因缺失株LA-A株和自然传代缺失致弱株LA2017株峰值均达108.0 TCID50/0.1 mL，展现出优良疫苗株的潜质。保存条件试验表明，PRV在-70 ℃保存30 d和4 ℃保存12 d内滴度相对稳定，而-20 ℃保存的病毒滴度下降明显。多次冻融后，滴度有所下降，相较于-70 ℃，-20 ℃条件下冻融病毒滴度下降更为显著，建议避免多次冻融。本试验结果可为PRV疫苗抗原在实际生产中制备与保存提供科学依据。

关键词：伪狂犬病病毒;猪睾丸细胞;仓鼠肾细胞;生长特性;冻融;保存

中图分类号： S852.65+5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0148-05

收稿日期：2020-04-23

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（18）3020];江苏省自然科学基金（编号：BK20181243）。

作者简介：陈赛赛（1993—），男，山西长治人，研究实习员，主要从事猪伪狂犬病疫苗及其防控技术的研究。E-mail：1304652436@qq.com。

通信作者：王继春，男，江苏南京人，博士，研究员，主要从事活载体疫苗和基因工程疫苗研究。E-mail：jcwang@263.net。  伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，简称PRV）引起的以家畜发热、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要特征的烈性传染病，又称Aujeszky病[1]。该病毒可感染不同日龄的猪，妊娠母猪感染后引起流产、产木乃伊胎或死胎，初生仔猪感染死亡率可达100%，成年猪一般为隐性感染，不表现临床症状，但长期带毒和排毒。在我国该病已涉及包括香港、台湾在内几乎所有地区[2]。美洲和欧洲许多国家通过应用基因缺失弱毒苗免疫，配合鉴别诊断等综合防控措施，成功将该病从家养猪场根除[3]，我国许多猪场也应用类似方法有效控制了该病。但自2011年以来，在我国一些Bartha株疫苗免疫的猪场又有该病的发生[4-6]，其特征为母猪产弱仔、死胎，流产，仔猪出现神经症状等临床症状，且死亡率较高，其地域包括黑龙江省、吉林省、天津市、河北省、湖北省、四川省、江苏省、广东省等，给我国养猪业造成极大的经济损失[4-6]，分析表明疫情由PRV变异株所引起。

疫苗接种是控制猪伪狂犬病最重要的措施，而免疫效果很大程度取决于抗原滴度。目前市场上所售的猪伪狂犬病疫苗在制备抗原时所用的细胞主要是鸡胚成纤维细胞，仓鼠肾（baby hamster kidney，BHK）细胞和猪睾丸细胞（swine testicular，简称ST）细胞，后2种细胞便于利用微载体培养和悬浮培养提高抗原滴度，是制备猪伪狂犬病疫苗的首选。

本试验将6株PRV在BHK和ST细胞上的增殖效率进行了比较，并且对不同保存条件下PRV的滴度变化进行了初步研究，以期为筛选疫苗候选株提供依据，同时为猪伪狂犬病疫苗生产工艺的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和主要试剂

病毒：Bartha K61株，购自西班牙海博莱生物大药厂，产品批次为66HP[7];AH02LA株为笔者所在实验室分离的PRV变异株[6]，保藏号码为：CGMCC No.10891;B-gD & gCS株是以Bartha K61株为母本，将其gD和gC基因替换为流行变异株AH02LA株的gD和gC基因的重组病毒株[8];LA2017株是以AH02LA株为母本经连续传代获得的致弱疫苗株，该毒株缺失了从gI基因第118位核苷酸至28K基因第251位核苷酸的共3 686碱基，包括gI部分基因、gE全部基因、11K全部基因和28K部分基因，保藏号码为：CGMCC No.18170;LA1206株，是以AH02LA株为母本，人工缺失gE和TK基因，再经连续传代80代获得的弱毒疫苗株，保藏号码为：CGMCC No.14329[9];LA-A株，是以AH02LA株为母本，人工缺失gE而得，用作PRV基因缺失灭活疫苗的种毒[10]。

细胞：BHK细胞和ST细胞，由笔者所在单位细胞工程组提供。

主要试剂：新生牛血清（newborn bovine serum，简称NBS）和DMEM培养基为Gibco公司产品。

1.2 病毒的培养与收获

取PRV各毒株，按0.01感染复数（multiplicity of infection，简称MOI）接种长满单层的BHK或ST细胞，吸附1 h后，吸去病毒液，应用无菌PBS液洗涤3次，加2% NBS的DMEM培养液37 ℃培养，待细胞病变达80%后，将上清与细胞混合物收集，在-70 ℃和37 ℃冻融，经8 000 r/min离心，取上清分装置-70 ℃保存。

1.3 病毒含量的测定

BHK和ST细胞传至96孔板长满单层，将PRV各毒株倍比稀释至10-1～10-9，每一稀释度接种8孔，每孔100 μL，对照组加100 μL细胞营养液，37 ℃ 孵育1 h后加入2% NBS的DMEM培养液100 μL，每日观察细胞病变，观察5 d，记录细胞病变情况，按Reed-Muench法计算细胞半数感染量（median tissue culture infectious dose，简称TCID50）。

1.4 病毒蚀斑形成特性

BHK和ST細胞传至六孔板长满单层，接种病毒稀释液，每孔100 μL，含50～100 TCID50，对照组加100 μL细胞营养液，37 ℃孵育1 h后加入2% NBS的DMEM培养液100 μL，每隔3～5 h观察细胞病变情况。

1.5 生长曲线测定

将PRV各病毒株分别以0.01 MOI接种长满单层的6孔板上的BHK或ST细胞，37 ℃孵育1 h，吸去上清，PBS洗涤3次，添加含2% NBS的DMEM培养液，每孔2 mL，37 ℃培养，分别于接种后6、12、24、36、48、72 h测定培养物中病毒含量，统计所有时间点的病毒滴度，绘制生长曲线。

1.6 不同温度和多次冻融对病毒滴度的影响

将相同滴度的Bartha K61株和AH02LA株分别放置在37、4、-20、-70 ℃一段时间后，检测其病毒的滴度，如“1.3”节所述。并且在-20 ℃和-70 ℃条件下，短时间内（72 h完成7次冻融）反复冻融，检测其病毒的滴度，如“1.3”节所述。

2 结果与分析

2.1 病毒含量

从表1可以看出，各毒株在ST和BHK细胞上适应性良好，滴度达106.57 TCID50/0.1 mL以上，可满足生产需要。

2.2 病毒蚀斑特性

6种PRV毒株在ST和BHK细胞上病变明显。接种相同剂量的病毒，病变发生的进度不完全一致，Bartha K61和B-gD & gCS在ST细胞上的病变时间明显滞后于其他毒株，且病变形态表现为细胞堆积，颗粒增多。AH02LA强毒株以及由AH02LA株衍生出来的LA2017株、LA1206株和LA-A株，在ST细胞上产生病变的形态基本一致，空斑明显，出现多数大小不一的融合细胞，AH02LA强毒株病变进展最快，大小空斑连成一片，融合细胞多且大。AH02LA强毒株在BHK细胞上也出现明显的融合细胞，而其他毒株在BHK上的融合细胞不明显，主要出现空斑和细胞变圆等现象（图1）。相对于ST细胞，所有PRV在BHK细胞上出现病变的时间更早。

2.3 生长动力学测定

从图2、图3可以看出，各毒株滴度峰值出现在36～48 h之间。对于BHK细胞，大多数毒株的峰值出现在36 h。而在ST细胞上，除AH02LA毒株的峰值出现在36 h外，其余毒株的峰值都出现在48 h。Bartha K61株、基因缺失株LA-A以及由强毒株AH02LA自然传代致弱的LA2017株其滴度峰值都能达到108.0 TCID50/0.1 mL，这十分有利于疫苗的研发。综上所述，强毒株在2种细胞上增殖滴度均能达到108.0 TCID50/0.1 mL以上，表现为发生病变早，病毒增殖快，峰值到来早。各毒株在ST细胞上的滴度峰值均大于同期在BHK细胞上的值。

2.4 不同保存温度对病毒滴度的影响

将相同滴度（106.0 TCID50/0.1 mL）的Bartha K61株和AH02LA株样品分别放置在 37、4、-20、

-70 ℃，一段时间后检测病毒滴度。结果发现病毒液在37 ℃保存3～12 d，其滴度下降趋势十分明显。-70 ℃保存30 d，滴度变化不大;4 ℃保存3～12 d，滴度基本无变化;而-20 ℃保存7 d，病毒滴度下降非常明显（表2）。说明Bartha K61株和AH02LA株在 -70 ℃ 和4 ℃保存12 d内稳定性较好。

2.5 多次冻融对病毒滴度的影响

将相同滴度的Bartha K61株和AH02LA株样品分别放置在-20、-70 ℃， 短时间内（72 h完成7次）反复冻融，检测滴度变化。结果表明，Bartha K61株与AH02LA株-20、-70 ℃冻融多次后滴度有降低趋势。-20 ℃冻融7次后滴度下降接近90%，-70 ℃ 条件下，3次冻融滴度下降较低。多次冻融后，效价有所下降，-20 ℃条件下冻融比 -70 ℃ 条件下冻融滴度下降趋势明显（表3）。

3 讨论与结论

PRV可在多种细胞上增殖，如猪肾细胞、非洲绿猴肾细胞、ST细胞、BHK细胞、牛肾细胞和鸡成纤维细胞[11-15]。基于对PRV的敏感性和增殖效率

以及规模化生产等因素，通常选取BHK细胞与ST细胞作为最终的生产用细胞。本试验将6株PRV在BHK和ST细胞上的增殖效率进行了比较。试验中所有毒株均能在BHK和ST细胞上产生明显病变，强弱毒株病变的形态存在明显差异，强毒株表现出巨融合细胞的出现以及病变时间超前等特性，本结论与程晓霞等报道的结果[13]一致。观察体外生长特性发现病毒增殖的整个过程经历增殖期和高峰期，而后出现下滑期。对于BHK细胞，多数毒株的峰值出现在36 h，而在ST细胞上峰值出现在48 h（强毒株AH02LA除外），说明PRV在BHK细胞上增殖速度较快。此外，研究发现基因缺失株 LA-A 株、由强毒株AH02LA自然传代致弱的LA2017株和经典的弱毒株Bartha K61株在BHK和ST细胞上的滴度峰值都能达到108.0 TCID50/0.1 mL以上，这十分有利于PRV疫苗抗原的制备。在实际的生产中，ST细胞可用于活疫苗与灭活疫苗的生产，本研究发现PRV在BHK细胞上出现病变的时间较早，病毒含量较高，在节省时间的同时，又能获得较高的抗原浓度，因此，BHK细胞也可作为PRV增殖的理想细胞，考虑到其致瘤性的隐患，一般用于灭活疫苗抗原的制备。

此外，在PRV抗原实际的生产中，在抗原收获后需要进行短时间保存，并且需要冻融离心去除细胞碎片，因此，本试验研究了抗原在-70、-20、4、37 ℃ 温度条件下短期保存对病毒滴度的影响。结果表明，病毒不宜-20 ℃保存，-70 ℃是理想的保存温度，但是实际生产中抗原产量较大，-70 ℃保存需要消耗大量能源，因此可选择4 ℃短期保存（不超过12 d）。病毒冻融试验结果显示，PRV抗原-20、-70 ℃条件下冻融多次后滴度均有所下降，为维持抗原稳定，应避免多次冻融，必要时可选择-70 ℃条件下冻融3次以内。

综上所述，本研究从实际生产出发，開展的PRV生长特性以及不同保存温度和反复冻融对病毒滴度的影响，其目的是提高抗原滴度，保护抗原活力，为疫苗的生产提供科学依据。

参考文献：

[1]殷 震，刘景华. 动物病毒学[M]. 2版.北京：科学出版社，1997：700-713.

[2]邓仕伟，汪 勇，薛春芳. 我国伪狂犬病流行现状及新特点[J]. 动物医学进展，2006，27（9）：105-107.

[3]Ketusing N，Reeves A，Portacci K，et al. Evaluation of strategies for the eradication of pseudorabies virus （Aujeszkys disease） in commercial swine farms in Chiang-Mai and Lampoon provinces，Thailand，using a simulation disease spread model[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2014，61（2）：169-176.

[4]彭金美，安同庆，赵鸿远，等. 猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J]. 中国预防兽医学报，2013，35（1）：1-4.

[5]An T Q，Peng J M，Tian Z J，et al. Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs，China，2012[J]. Emerging Infectious Diseases，2013，19（11）：1749-1755.

[6]乔永峰，顾一奇，柳 畅，等. 猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究[J]. 畜牧与兽医，2016，48（12）：36-41.

[7]王继春，曾容愚，Torrents D，等. 猪伪狂犬病活疫苗（Bartha K61株）对变异株的保护效力[J]. 畜牧与兽医，2015，47（12）：1-4.

[8]Zhang C J，Liu Y M，Chen S，et al. A gD & gC-substituted pseudorabies virus vaccine strain provides complete clinical protection and is helpful to prevent virus shedding against challenge by a Chinese pseudorabies variant[J]. BMC Veterinary Research，2019，15：2.

[9]刘娅梅，乔永峰，顾一奇，等. 猪源伪狂犬病病毒变异株AH02LA株细菌人工染色体的构建与鉴定[J]. 中国预防兽医学报，2018，40（10）：880-885.

[10]Wang J C，Guo R L，Qiao Y F，et al. An inactivated gE-deleted pseudorabies vaccine provides complete clinical protection and reduces virus shedding against challenge by a Chinese pseudorabies variant[J]. BMC Veterinary Research，2016，12：277.

[11]李小静，唐满华. 猪伪狂犬病病毒在不同细胞上的增殖研究[J]. 吉林畜牧兽医，2015，36（6）：14-16.

[12]王 岩，杨明凡，崔保安，等. PK15、Vero、BHK-21、CEF细胞增殖猪伪狂犬病病毒的比较[J]. 安徽农业科学，2007，35（18）：5432-5445.

[13]程晓霞，陈少莺，胡奇林，等. 猪伪狂犬病病毒在几种细胞中增殖情况的比较[J]. 福建畜牧兽医，2006，28（6）：37-38.

[14]王树成，赵祥平，董志珍，等. 用PK15、VERO和MDBK三种细胞增殖猪伪狂犬病病毒的比较[J]. 畜牧与兽医，1996，28（2）：80.

[15]彭丽英，倪建平，张婉华，等. 猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖的研究[J]. 上海农业学报，2011，27（4）：67-69.任义军，孙大明，俞晓鹏，等. 哺乳期麋鹿的生长发育与疾病发生的关系[J]. 江苏农业科学，2020，48（11）：153-157.