玛瑙红樱桃病毒病小RNA的高通量测序检测

洪 怡， 文 壮， 田 田， 文晓鹏

(贵州大学 农业生物工程研究院/生命科学学院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

植物病毒病又称为植物癌症，给农作物和经济作物带来严重危害，使作物产量减少、品质变劣，每年在全球造成的经济损失达200 亿美元[1]。病毒病是严重危害到樱桃生产的重要病害，侵染樱属病毒主要有 68种，侵染大樱桃的病毒约有 34 种，较常见主要有 20 种[2]。目前有关樱桃病毒病的研究多侧重于大樱桃病毒病相关研究，我国已发现的大樱桃病毒病病原有樱桃病毒 A (CherryvirusA,CVA)、樱桃绿斑驳病毒 (Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)、樱桃小果病毒 1 (Littlecherryvirus1,LChV-1)、樱桃小果病毒 2 (Littlecherryvirus2,LChV-2)、李树皮坏死与茎痘伴随病毒 (Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV)、李属坏死环斑病毒 (Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV)、李矮缩病毒 (Prunedwarfvirus,PDV) 和黄瓜花叶病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV) 等[3-5]。赵慧等[6]在用于砧木使用的中国樱桃实生苗上检测出李属坏死斑病毒、樱桃绿环斑驳病毒、苹果褪绿叶斑病毒、樱桃坏死锈斑病毒(cherrynecroticrustymottlevirus,CNRMV)和樱桃小果病毒 2。玛瑙红樱桃(Prunuspseudoceresus‘Manaohong’)是贵州省经多年选育而成的地方优良品种[7-8]，经过20余年的推广，目前是贵州省种植面积最大的樱桃品种。玛瑙红樱桃营养丰富，成熟期早，市场价格高，在贵州脱贫攻坚、生态文明建设、农业供给侧结构性改革、增加农民收入等方面发挥了重要作用，具有较高的社会及经济效益。在种植过程中发现，玛瑙红樱桃出现大面积叶片黄化的疑似病毒侵染症状，甚至导致树体死亡，严重影响其产量及质量。检测玛瑙红樱桃病毒病，对了解病毒病发病情况及防治和控制病毒病具有重要意义。

检测植物病毒的传统方法有血清学检测、电子显微镜观察、指示植物接种和基因芯片等，若是未知病原物，则耗时长、效率低下，而且容易出现检测误差等问题[9-11]。随着基因测序技术的不断发展，高通量小 RNA 测序技术开始进入植物病毒检测领域。植物在受到病毒侵染时会形成干扰小 RNA，干扰小 RNA 作为一种防御机制，广泛存在于植物对抗各种病原物侵染的过程中，若植物被病毒感染，在高通量测序中获得的小 RNA 序列库中就会含有来源于病毒的序列，通过比对分析就能得到病毒相关序列[12-13]。高通量测序技术因其快速、灵敏的检测特点已经成为植物病毒学研究的有力工具，是一种广谱性的病毒检测手段，可检测到未知病毒。VERBEEK 等[14]于2011年通过高通量测序在荷兰种植的莴苣上检测到1种新病毒，这种病毒导致莴苣叶基部坏死并伴随叶卷曲。小 RNA 的高通量测序可在病原物侵染早期进行快速准确的检测，即在植物被感染早期，还未出现明显症状之前就可检测到病原物的存在，为后续的病原物防治争取时间[15]。目前，鲜见对贵州樱桃玛瑙红病毒病的研究报道，故采用高通量技术分析玛瑙红樱桃可能携带的病毒病种类，以期为玛瑙红樱桃病毒病的防治与控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

玛瑙红樱桃叶片，采自贵州省福泉市黄丝镇、毕节市纳雍县、六盘水市六枝特区的玛瑙红樱桃种植园。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理及小RNA测序 分别采集纳雍(NY)、福泉(FQ)、六枝(LZ)3个地区樱桃叶片，每个采样点分别选取 2个试验样品，采集时间为 6月，选取黄化叶片(参照图1进行选取)，液氮快速处理后带回实验室，置于干冰中，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行总RNA 的提取及质检、文库构建和高通量测序等，测序平台为Illumiina Hiseq 2500。

1.2.2 测序数据过滤及18～26 nt小RNA筛选 对原始数据经过过滤，去掉低质量、接头和过长片段，并去掉 3’接头后长度小于 18 nt和大于 26 nt的片段数，获得 clean reads片段。由于病毒感染的植物，富集的病毒小RNA长度主要分为3类：21 nt，22 nt和24 nt[16]，因此从clean reads中筛选长度 18～26 nt 的sRNA进行后续分析。

1.2.3 样品病毒分析 使用 Velvet(参数 K-mer17)对筛选所得的小 RNA进行序列拼接，获得较长的重叠群(contigs)。将拼接所得的contigs与寄主基因组数据库进行比对，除去寄主基因组序列；将剩余的重叠群用 blastn与核酸数据库进行比对，寻找与这些重叠群高度同源的序列；用 blastx将没有找到高度同源序列的 contigs与蛋白质数据库进行比对，寻找与 contigs部分同源的序列；将contigs高度同源序列和部分同源序列分别与病毒核酸数据库和病毒蛋白数据库进行比对，筛选出与病毒序列同源的 contigs；为评估该候选病毒的有效性，用 bowtie 将过滤后的小 RNA(允许1 mismatch)，与 GenBank Virus RefSeq中NY 筛选出的候选病毒核酸序列组成的数据库进行比对，并将小 RNA 进一步定位到该数据库中，鉴定出病毒小 RNA。

2 结果与分析

2.1 樱桃叶片小RNA的高通量测序数据质量

2.1.1 小RNA测序数据质量 从表1可知，纳雍、福泉、六枝3个文库分别获得21 203 575条、33 782 705条和324 192 271条原始读数(raw reads)，去除低质量、污染读数后，最终获得2 063 199条、32 772 749条和31 642 051条干净读数(clean reads)，其 clean reads 比例均达95% 以上，满足后续生物信息学分析要求。

表1 樱桃叶片小RNA的高通量测序数据质量统计

2.1.2 18～26 nt小RNA条数 从表2可知，纳雍、福泉和六枝样品获得长度介于18 ～ 26 nt的 小 RNA分别为17 645 715 条、25 667 682条和28 004 194条。从测序获得的小 RNA 长度看，小 RNA 长度主要在 21～24 nt，尤其以 21 nt 和 24 nt 占比较高(图2)，纳雍、福泉、六枝样品的 21 nt小 RNA分别占筛选出小 RNA的 20.92%、21.07%和23.39%，24 nt小 RNA分别占 48.57%、39.63%和45.10%。

表2 樱桃叶片18～26 nt小RNA的条数

2.2 樱桃叶片小 RNA的拼接与注释

从表3可知，对筛选所得18～26 nt的小 RNA进行拼接，纳雍、福泉和六枝分别获得 4 514条、5 959条和 7 046条contigs。纳雍样本在病毒核酸、蛋白数据库中注释到的contigs 最多，分别有11条和40 条，福泉样品被病毒核酸、蛋白数据库注释到的contigs 分别有1条 和 19 条，六枝样品被病毒核酸、蛋白数据库注释到的contigs 分别有 2条 和 17 条。

表3 樱桃叶片小RNA在数据库的 contig 注释数量

2.3 候选病毒

从表4可知，纳雍样本中鉴定到 5 种候选病毒，其中与 Little cherry virus 2 同源的 contigs 最多，为49条；其次与急球藻噬菌体(Synechococcusphage) 和西部云杉色卷蛾颗粒病毒(Choristoneuraoccidentalisgranulovirus) 同源的 contigs分别为 5条和 2条；检测到与甘薯杆状DNA病毒B(SweetpotatobadnavirusB)、花椰菜花叶病毒(Cassavaveinmosaicvirus)同源的 contigs 均为1条。福泉样本中检测到的主要病毒包括Synechococcusphage、SweetpotatobadnavirusB、Choristoneuraoccidentalisgranulovirus和花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus)等 6 种，以Synechococcusphage和SweetpotatobadnavirusB同源的 contigs 较高，分别为 7条 和 3条。六枝样本中检测到的病毒Synechococcusphage和Cauliflowermosaicvirus同源的 contigs 分别为 8条 和 2条，其余与候选病毒同源的 contigs 均为 1条。

表4 樱桃叶片检测病毒的类别

通过对 3个采样地的样本候选病毒的初步筛选，纳雍样本中鉴定到的樱桃小果病毒 2可能为樱桃叶片中的主要病毒，其余2组样本中鉴定的主要病毒为噬菌体或者昆虫病毒，含有少量的植物病毒。通过对候选病毒的有效性评估、鉴定，在纳雍样本中的候选病毒库中，樱桃小果病毒 2比对到的 reads 有6 014条，占总参考序列 mapped reads的75.62%，说明筛选候选病毒有效，纳雍样本中包含的病毒主要为樱桃小果病毒 2(表 5)。

表5 纳雍样本候选病毒的有效性评估

3 结论与讨论

经检测鉴定，贵州省玛瑙红樱桃纳雍样本中的候选病毒库中，樱桃小果病毒 2比对到的 reads 有 6 014条，占总参考序列 mapped reads的75.62%，存在病毒病。纳雍县玛瑙红樱桃产区主要存在樱桃小果病毒 2，其余部分产区樱桃黄化症状并非由病毒引起。

常规的病毒检测方法电镜法、酶联免疫法 (ELISA) 、聚合酶链式反应法 (PCR)等，都有一定的局限性，如只适用于研究比较清楚的病毒，针对性强，对于新病毒的发现较困难，且易漏检。与传统方法相比，高通量小 RNA测序检测病毒病是利用植物抗病毒机制建立的一种检测手段，对小 RNA进行高通量测序，然后组装总小 RNA来检测病毒，能同时鉴定样品中存在的所有病毒，高通量测序技术在病毒的发现与鉴定研究中发挥了巨大优势[17-18]，能够快速地检测样品中存在的所有病毒，具有更高的灵敏度和信噪比，并且检测结果不存在假阳性。随着测序成本的不断降低，基于小 RNA深度测序技术逐渐成为检测植物病毒最准确、最常用的方法[19]。研究利用小 RNA测序及组装技术在玛瑙红樱桃上检测到8种候选病毒，其中，樱桃小果病毒 2为主要病毒，且候选病毒的有效性评估也证明了主要病毒为樱桃小果病毒2，樱桃小果病毒 2属于长线型病毒科葡萄卷叶病毒属，仅感染李属植物，传染性强，可引起果实变小，不能成熟等，严重影响樱桃的商品价值[20]。

在此次检测中，在纳雍主产区检测出樱桃小果病毒 2，其他 2个产区未检出，推测樱桃小果病毒 2还未在全省大面积传播，部分地区玛瑙红樱桃的黄化现象应是由其他原因导致。纳雍是玛瑙红樱桃的发源地，许多苗木都出自纳雍，虽然目前病毒病还未大范围传播，但樱桃小果病毒 2致病性强，传播快，若不及时防控，将会给贵州的玛瑙红樱桃产业带了巨大打击，相关部门应引起重视。