吉林省龙井市牛东方泰勒虫的流行病学调查

刘士煌，郑添予，朱奕霏，吴保义，张 燕，金春梅，于龙政

延边大学农学院，吉林延吉 133000

牛东方泰勒虫病是由泰勒科、泰勒属的东方泰勒虫寄生在牛的红细胞及淋巴细胞内的一种蜱传性原虫病。临床表现为高烧，异常消瘦，贫血和体表淋巴结肿大等，严重情况下可将牛致死，对牛机体危害极大[1]。该病分布广泛，有明显的地域性，在俄罗斯远东地区、韩国、日本、澳大利亚等国家及地区均有报道[2]，我国从1964年初次在贵州省被报导乳牛血液中发现牛东方泰勒虫以来，我国各个地区也接踵报道了该病。1980年，关明浩等[3]首次报道吉林省存在牛东方泰勒虫病，这种疾病的发现是从外地向集安县引进的22 头牛中，发现22 头牛的染病率为100%，死亡率高达13.6%。随着我省养牛业的普遍发展和流行，至今，吉林省各地区已有10个县市均有牛东方泰勒虫病的普遍流行[4]。

牛东方泰勒虫裂殖子主要表面蛋白(MPSP)基因是泰勒虫属的一种保守性蛋白，在温和性泰勒虫属中，该基因已成为流行病学调查和研究的标志性蛋白[5]。1995年，Kubota S 等根据MPSP 基因（p33/p32）设计了2 对引物，可扩增I 型和C 型p33/p32 基因，结合扩增产物的酶切分析，发现所研究的大多数牛东方泰勒虫感染的犊牛都至少含有两种不同型的混合感染。1996年，Kubota S 等根据水牛泰勒虫基因，设计了另外一对引物，结合I 型和C 型p33/p32 基因对应的2 对引物，PCR 和扩增产物酶切分析日本和澳大利亚的瑟氏/水牛泰勒虫，发现有4个不同的等位型（C 型、I 型、B1 型和B2型）。本试验以牛东方泰勒虫裂殖子主要表面蛋白基因(MPSP)为靶标，使用等位特异的PCR 方法，运用三对不同的等位特异型引物(Chitose C-、Ikeda I-和buffeli B-型)做PCR 检测，对吉林省龙井地区的牛东方泰勒虫的多态性进行分析，采用血涂片染色镜检法并结合PCR 方法，对牛东方泰勒虫病进行分子流行病学调查。

1 材料与方法

1.1 引物的合成

依据Yu[5]文献合成东方泰勒虫扩增引物及基因分型引物，通用引物为Ts-U 和Ts-R；I-型分型引物为TS-R 和TS-I；C-型分型引物为TS-R 和TS-C；B-型分型引物为TS-R 和TS-B。

1.2 血液样本的采集

样品采自吉林省龙井市某牛场，颈静脉无菌采集抗凝血，现场制备血液涂片，共采集53 份。

1.3 血涂片镜检

血液涂片，甲醇固定2 min，自然干燥，50 倍稀释的姬姆萨原液（默克公司）浸染12 h，在光学显微镜下进行虫体检查。

1.4 DNA 的提取

按全血DNA 提取试剂盒（Takara 公司）操作说明书步骤分别提取53 份龙井牛的血液样本中牛东方泰勒虫基因组DNA。

1.5 PCR 扩增与分型鉴定

反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延 伸1 min，进行35个循环，最后72 ℃延伸7 mi n。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR 扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 统计学分析

运用SPSS 进行方差分析血涂片镜检结果和PCR 结果的结果分析。

2 结 果

2.1 血涂片染色镜检结果

53 份涂片经姬姆萨氏染色后，可在光学显微镜下观察到牛红细胞内的东方泰勒虫体，红细胞染色质呈淡红色，虫体包浆呈蓝紫色，如图1 所示。所采集的样本中有15 份呈血液涂片镜检阳性，阳性率为28.30%（15/53）。

图1 血液涂片姬姆萨染色镜检结果（×1000）

2.2 PCR 检测结果

53 份龙井地区的血液样本用引物Ts-U 和Ts-R进行PCR 检测，其中17 份被检测呈阳性，阳性率为32.08%（17/53）。部分血液样本东方泰勒虫PCR 检测结果，如图2 所示。

图2 部分血液样本东方泰勒虫PCR 检测结果

2.3 东方泰勒虫基因型分析

对已挑选的阳性样品，分别使用三对不同的等位特异型引物(Chitose C-型、Ikeda I-型和buffeli B-型)做PCR 检测，结果表明：17个阳性样品基因型属C-型和I-型，C-型的阳性率和I-型的阳性率均为13.21%（7/53），而B-型仅为7.55%（4/53），且有两种基因型的混合感染，B 型和I 型混合感染率为1.87%（1/53），B 型和C 型混合感染率1.87%（1/53），并且还存在两个阳性未测出类型。图3A 为部分阳性血液样本东方泰勒虫PCR C-型检测结果，图3B 为部分阳性血液样本东方泰勒虫PCR I-型检测结果，图3C 为部分阳性血液样本东方泰勒虫PCR B-型检测结果。结果显示，在吉林省延边朝鲜族自治州龙井市牛东方泰勒虫存在至少三种亚型，即T.orientalis C 型、T.orientalis B 型和 T.orientalis I 型。

图3 部分阳性血液样本东方泰勒虫分型PCR 检测结果

2.4 PCR 检测结果与血涂片结果对比分析

53 份液样本经PCR 检测，其中17 份阳性，阳性率为32.08%（17/53），而镜检结果阳性为15 份，阳性率为28.30%（15/53）。部分血液样本东方泰勒虫PCR 检测结果明显高于镜检的阳性率，经统计学分析得出，差异极显著（p＜0.01）。53 份血液样本中，PCR 方法检测的阳性率为32.08%(17/53) 明显高于姬姆萨染色法检测的阳性率28.30%(15/53)，其中有2 份在镜检中观察认为阴性的2 份血液样本经PCR 检测后也为阳性，说明PCR 方法比姬姆萨染色镜检法更为敏感。

3 讨论

牛东方泰勒虫病是一种慢性、消耗性的寄生虫病。牛感染东方泰勒虫后经过一段的急性期，常进入慢性无临床症状时期，成为牛东方泰勒虫的携带者，牛在整个生命周期中可能会持续感染该虫体、虽然，牛东方泰勒虫病很少引起牛的死亡，但是，该虫体长期隐匿于牛体内，严重影响到牛的生长发育和牛类产品的产量和质量，给养牛业带来了严重的经济损失[6]。牛东方泰勒虫通过系统进化树分析，存在十几种基因型，目前只有C-型、B-型、I-型、Thai-型可以通过PCR 方法进行区分，其他基因型需要通过基因测序知道其分型，本试验中未能通过PCR 检测出的类型可能属于C-型、B-型、I-型之外的一种基因型。

结果显示，龙井市是牛东方泰勒虫病的流行地区，存在至少三种MPSP 基因型，导致这种情况的原因可能是多数的长角血蜱都生活在山区的灌木丛中，由于龙井市的地区处于山区，非常适合长角血蜱的生长和繁育，所以龙井牛接触长角血蜱的概率相对其他地区会比较大，从而非常容易感染牛东方泰勒虫病。其次，可能由于畜舍环境卫生、消毒措施不到位，没有专业防护手段，导致蜱进入畜舍内叮咬了牛从而感染。牛东方泰勒虫病在该地区处于流行趋势，且呈明显上升趋势，该病已经对其地区及周边地区的养牛业造成了严重的威胁[7]，有关部门应当采取相应的措施进行有效的防治和预防该病的持续流行。