非洲猪瘟实验室检测方法综述

樊晓旭 ， 赵 明 ， 赵永刚 ， 张志诚 ， 吴晓东 ， 王志亮

(1. 中国动物卫生与流行病学中心 ， 山东 青岛 266032 ； 2. 青岛市动物疫病预防控制中心 ， 山东 青岛 266100)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)感染家猪和野猪(如欧亚野猪)引起的一种急性、热性、烈性传染病。该病致死率高达100%。一旦暴发，往往给受灾国家和地区养猪业造成不可估量的损失和影响。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。自 1921 年首次报道以来，非洲猪瘟从非洲传播至欧洲、南美洲、亚洲等的多个国家。近一年来，非洲猪瘟病毒传播速度明显加快，呈现愈演愈烈之势。据OIE 通报数据显示，2019年1-12月期间，曾暴发或者正在暴发非洲猪瘟疫情的国家有28个,包含欧洲国家13 个、亚洲国家12个和非洲国家3 个，其中亚洲几个国家的疫情尤为严重。由于至今依然缺乏公认安全有效的疫苗和药物用于预防、控制和治疗非洲猪瘟，早发现、早诊断、早处置、提高生物安全管理水平是目前非洲猪瘟防控的主要措施。其中，准确、可靠的实验室检测方法，对于非洲猪瘟的防控至关重要。

本文检索了美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库1960-2019年收录的有关非洲猪瘟诊断方法方面的试验性文章，选取的关键词为“African swine fever”，同时包含“diagnosis”或“detection”，排除综述类、非诊断研究类文章，共纳入文章103篇。其中，病原学检测方法72篇，血清学检测方法31篇。20世纪60年代10篇、70年代12篇、80年代12篇、90年代19篇、21世纪00年代17篇、10年代33篇。从发表文章数量可以看出，非洲猪瘟检测相关文章总体呈现上升趋势，特别是在最近10年，文章数量明显上升(见中插彩版图1)。非洲猪瘟实验室诊断方法按照时间可大致划分为3个阶段：20世纪60-70年代，主要利用病毒本身特性，例如血吸附性、感染致细胞病变(CPE)，以及抗原抗体特异性结合原理，辅以琼脂扩散、沉淀、放射性扩散、电泳、荧光素标记等手段，对ASF病原及抗体进行检测。20世纪80-90年代，一方面，ELISA、免疫印迹方法进一步发展，逐渐成为主流的血清学检测方法；另一方面，除了建立直观显微观察CPE和夹心ELISA方法外，随着分子生物学的发展，DNA分子杂交和PCR技术也逐步应用到ASFV病原学检测中。21世纪最初20年，普通PCR技术、荧光定量PCR技术以及各种等温核酸扩增技术得到长足发展，检测的灵敏性得到显著提高。通过化学发光、免疫微球和胶体金技术，使基于抗原-抗体结合反应的诊断技术操作更加便捷。多重PCR、微阵列和液相芯片技术，使同一时间检测多种病原成为可能。本文以时间为主线，回顾非洲猪瘟实验室检测方法的发展历程，以期为非洲猪瘟的诊断乃至防控提供参考。

1 20世纪60-70年代

1960年，Malmquist和IHay发现正常的猪红细胞会吸附在感染非洲猪瘟病毒的细胞表面，且大多数ASFV分离株都会产生这种现象。从NCBI数据库中可查，1965年，前苏联科学家报道了通过红细胞吸附试验(HAD)鉴定非洲猪瘟病毒[1]。尽管并不是所有的非洲猪瘟病毒都具有血吸附特性，但该方法迄今依然是鉴定病毒、测定病毒含量(HAD50)的重要手段。非洲猪瘟病毒在原代猪肾细胞中传代，尽管病毒毒力发生一定变化，但红细胞吸附能力依然保留。1966-1967年，法国Boulanger等利用当时流行的试验技术，报道了各种非洲猪瘟病毒的检测方法[2]。例如，利用改良的直接补体固定试验或琼脂凝胶双扩散技术，可成功检测到病猪脾脏和肝脏中的病毒抗原。将异硫氰酸荧光素与血清偶联建立免疫荧光检测病毒抗原的方法，能够检测到冷冻组织切片、血涂片和培养细胞物中病毒抗原，不受猪体中抗体的干扰。同时，利用不同颜色的荧光素偶联，能够区分非洲猪瘟和古典猪瘟病毒(CSFV)抗原，也是最早报道的非洲猪瘟与其他病原的实验室鉴别诊断方法[3]。而经过不断的优化和改进，直接免疫荧光法(FAT)目前仍是直观观测非洲猪瘟病毒在组织细胞中分布的重要手段。

在20世纪70年代，涌现出多种ASF抗体检测方法。免疫电渗电泳方法被应用于ASF特异性抗体的检测，反应仅耗时30 min。此外，西班牙实验室开发了高丙种球蛋白血症与碘凝集试验、反向单向放射免疫扩散等方法用于检测血清中的抗体。间接免疫荧光和微型血清样品承载波片用于大规模的抗体监测工作[4]。1979年，人们开发了一种同时检测非洲猪瘟病毒抗原和抗体的固相放射免疫分析方法(RIA)，可最低检测到相当于50～500 HAD50/mL的抗原浓度。这种直接或间接抗体RIA，比现有的补体结合试验灵敏约100倍，比免疫电渗电泳抗体检测方法敏感1 000倍，且方法的重复性良好[5]。随着酶联免疫吸附试验(ELISA)的发明，在1979年，文章首次报道了ELISA在ASF检测中的应用。Wardley等对ELISA方法进行了进一步评价，证实该方法最低能够检测到50～500 HAD50/mL抗原，且比目前ASF抗体检测方法更为灵敏[6]。进而，《OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册》中也对该方法进行了描述，认为ELISA可分别用于血清和组织液中抗体及抗原的检测。

2 20世纪80-90年代

到了20世纪80年代，一方面，科学家们对现有的ELISA、RIA方法进一步做了临床应用评价和改进；另一方面，一些新技术也逐渐应用到ASF检测中。例如，简化了免疫电渗电泳检测方法，并开发了间接免疫过氧化物酶斑点染色法(IPT)用于检测非洲猪瘟病毒抗体。在敏感性和特异性方面，该方法与间接免疫荧光法相当，可用于抗体监测及确诊。1987年，荷兰Knudsen等开发了猪单核白细胞(MNL)微培养测定ASFV含量的方法。通过倒置显微镜放大40倍，观察ASFV感染单核细胞后的细胞病变效应(CPE)。感染单核细胞开始分离、扩大和变圆，逐渐形成葡萄状的3～20个或更多的细胞团，最终裂解。值得注意的是，强毒株、中等毒力毒株、Vero细胞适应株和无红细胞吸附特性毒株都可产生特征性CPE。这种细胞病变微量测定法(TCID)的灵敏度和重复性与HAD法相近[7]。随着分子生物学的发展，针对非洲猪瘟检测，也相应开发制备了多种检测材料。例如，针对非洲猪瘟病毒14、32、73、174 kDa和240 kDa蛋白制备了一系列单克隆抗体，可应用到免疫电子显微镜观察和放射免疫分析中。荷兰科学家利用抗IgG和IgM混合单抗建立的同种型特异性免疫过氧化物酶单层试验方法，其敏感性高于ELISA，可用于血清学筛查[8]。奥地利实验室构建了含有非洲猪瘟病毒西班牙70株H-ClaI基因片段(5.6 kbp)的pRPEL2重组质粒，采取磷32标记杂交探针，开发了DNA-DNA杂交方法。利用硝酸纤维素纸固定ASFV DNA，最低检出限达20 pg。相比之下，非放射性磺化DNA探针的灵敏度约为4 ng，生物素化DNA探针的灵敏度约为400 pg[9]。20世纪80年代末，建立了采用免疫印迹法检测非洲猪瘟病毒抗体，并进一步研究确定了检测方法的干扰因素、电转及免疫反应条件、膜材料，证实病毒p30蛋白敏感性最佳[10]。

1990年，西班牙利用临床血清样品，对放射免疫沉淀法(RIPA)、免疫印迹和ELISA进行了比较研究，结果发现，3种方法的敏感性相当，RIPA和ELISA方法较免疫印迹更早检测到ASF抗体阳性[11-12]。在比较了感染细胞的细胞质可溶性部分(CS-P)和半纯化病毒结构蛋白p72作为抗原建立的2种ELISA抗体检测法后，发现猪血清CS-P在感染猪的早期血清学检测中更具优势。此外，在硝酸纤维素条上结合CS-P，建立简易斑点免疫结合试验方法(DIA)，便于ASF抗体的检测。在一项ASFV病原检测比较研究中发现，夹心ELISA方法的检测限为2.3×102HAD50，免疫斑点法检测限为4.6×102HAD50，放射性DNA探针分子杂交检测限约为1.8×103HAD50[11]。夹心ELISA方法在检测人工感染ASFV后8 d之内的样本，出现了一部分假阴性结果，而在接毒后9～14 d，采集的样本均呈阳性。与病毒分离相比，ELISA方法需要的专业设施更少，检测耗时更短。但是，在ASF亚急性感染过程中形成了病毒抗体免疫复合物，导致免疫学方法出现漏检情况，提示分子杂交方法检测病毒DNA更有效。

1992年，西班牙Fernandez等首次报道了利用免疫组织学切片方法检测研究ASFV抗原，通过戊二醛固定含病毒组织，石蜡包埋，多克隆抗体检测，可观察组织超微结构中的病毒分布[13]。通过对不同地区、不同年份分离到的不同ASF野毒株的基因序列比较分析，发现编码ASF病毒蛋白p54和p30的基因E183L和CP204L高度保守。为了避免在生产过程中使用活病毒，通过大肠杆菌原核表达系统表达重组蛋白，改进了Western Blot检测方法。临床验证结果显示，p54可作为Western Blot检测ASF抗体的首选抗原，而p30更适于ELISA方法检测抗体的候选抗原，特别是病毒感染早期的抗体检测[14]。ASFV p72蛋白在世界各地分离的毒株中高度保守(97.8%～100%的氨基酸序列同源性)，利用抗p72的单克隆抗体建立的夹心ELISA，对p72抗原检测限为0.05 μg/mL，低于多克隆抗体的0.6 μg/mL检测限，可检测2.3×102PFU/mL全病毒粒子[15]。

在非洲猪瘟实验室诊断中，具有跨时代意义的标志是聚合酶链式反应(PCR)于1992年首次应用到ASFV检测中，瑞典Steiger等针对病毒基因组保守区640 bp片段设计了1对引物，成功检测到病毒感染的组织、全血及细胞培养物，之后采用巢式PCR和生物素化寡核苷酸探针杂交对试验结果进行了验证[16]。此外比较发现，PCR方法比HAD方法更快速、更灵敏，同时可采用病毒DNA克隆作为阳性对照，代替以往HAD方法的活病毒对照，在检测操作过程中更加安全。

3 21世纪最初20年

进入21世纪，基于PCR原理的ASFV诊断方法得到长足发展。特别是在马达加斯加临床分离到的ASFV毒株，在细胞内的生长没有表现明显的细胞病变或血液吸附作用，提示PCR和核苷酸测序方法在诊断中的必要性。为了避免由于反应过程本身出现问题导致样品检测出现假阴性，法国Gonzague等及英国King等分别在普通PCR方法和TaqMan荧光定量PCR方法中设置了内控品[17-18]。比利时Tignon等建立了含有猪肌动蛋白(β-actin)作为内参的荧光定量PCR方法，经不同参考实验室验证，检测限为5.7～57个基因组拷贝[19]。2013年, Fernandez-Pinero等针对ASFV p72片段设计了通用探针(UPL)，并附有β-actin作为内参质控，通过检测分属19个基因型的临床样本，验证其适用性，结果显示，比OIE推荐的TaqMan法灵敏性更高，具有良好的重复性和可靠性，目前得到多个实验室的应用[20]。TaqMan荧光定量PCR方法灵敏性高，可在试验感染猪发病前2～4 d在扁桃体刮片样本中检测到病毒核酸，检测时间不超过2 h。在灵敏性提升方面，Bastos等进一步利用巢式PCR技术，结合内控品，提高了灵敏性，可用于检测软蜱样品中微量的ASFV核酸[21]。英国McKillen等开发了针对ASFV 9GL基因的5′小沟结合(MGB)探针荧光定量PCR方法，探针设计长度更短，提高了探针设计的灵活性；探针包括一个不发光的猝灭基团(NFQ)，极大消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提高了检验灵敏度，检测限达20个基因组拷贝，较OIE推荐的PCR方法灵敏10倍[22]。Ronish等开发了指数后线性PCR(LATE PCR)，并含有内控DNA，能够直接扩增大量单链DNA，并在扩增后读取荧光信号，检测限为1～10个基因组拷贝，整个扩增反应约为1 h，适于实验室及现场快速诊断[23]。利用冻干技术，将荧光定量PCR酶制成粉末，在运输和保存中，可进一步确保反应效果。2017年，中国Luo等对普通PCR方法进行了优化，分析检出限达60拷贝[24]。2018年，中国Wu等建立了ASFV微滴式数字聚合酶链反应(ddPCR)方法，检测限为10拷贝/反应[25]。

南非Bastos等建立了一种基于PCR的测序方法，扩增与p72基因C末端478 bp片段，除了确认病毒的存在，还通过核苷酸序列测定和系统进化分析，进一步鉴定毒株遗传特征，确定其基因型，便于后续的ASF分子流行病学研究。该方法至今依然是主要的ASFV基因分型方法，根据此方法，目前全世界非洲猪瘟病毒可分为24个基因型[26]。瑞典Leblanc等利用液相芯片方法，根据p72基因C末端的序列变异确定的基因型分类标准。设计了长度为15 bp或17 bp的互补配对DNA探针，保留了中心位置的单核苷酸多态性(SNP)差异。共设计了52个探针，24个SNP对，4个通用检测探针[27]。使用xMAP技术，探针与微球共价连接，与PCR产物杂交，分析仪中读取结果。通过检测不同基因型临床样品发现，该方法能够检测和区分当时所有22个基因型。上述基因分型为确定毒株的地理分布提供了帮助和参考。2019年，美国梅岛动物疫病中心利用牛津纳米孔微子序列传感装置作为快速测序工具，结合的新软件脚本，开发了非洲猪瘟快速分析测序软件工具(ASF-Fast)，实现实时分析输出数据。通过去除提取核酸中宿主甲基化DNA，对血液样本和细胞培养分离物中的ASFV基因组序列，6 min内可检测到ASFV的特异性标记。在10 min内确保得到足够的序列用于全基因组分析[28]。

为了满足现场诊断需要，英国Hjertner等开发了一种Invader等温扩增方法，不依赖昂贵精密的PCR仪器，但是，该方法耗时较长，需要在63 ℃下孵育12 h，每20 min收集荧光信号，且灵敏性不如PCR方法，检测限为2 500个基因组拷贝[29]。英国King团队以ASFV拓扑异构酶Ⅱ基因为靶点，建立了ASF环介导等温扩增(LAMP)方法。分析灵敏度至少为330个基因组拷贝，与荧光定量PCR法有很好的一致性，有望应用在现场快速诊断[30]。波兰科学家开发了交叉启动扩增(CPA)，该方法可在水浴56 ℃启动反应，耗时45 min，最低检测限达720拷贝/反应[31]。相类似的是该国科学家又开发了聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)，反应耗时与检出限与CPA相当，可利用SYBR Green I荧光染料颜色变化或电泳对结果进行判定[32]。通过对LAMP和CPA进行临床验证发现，其灵敏度分别达90%和70%。目前适用于ASF的初步诊断，但仍需进一步改进以提高其诊断的敏感性。中国、西班牙、瑞典科学家联合开发了ASFV和CSFV双重实时PCR方法(称为“T-COR4分析”)，扩增反应可在一个便携式、电池驱动的PCR热循环仪上进行，从样品处理到读取结果共需3 h[33]。2017年，中国Wang等基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术，建立了一种快速、特异的ASFV检测方法。采用Genie-III扫描仪进行扩增反应。利用含有ASFVp72片段的重组质粒作为模板，在10 min内即可检测到扩增产物，检测限为100 拷贝/反应，灵敏度与荧光定量PCR相当[34]。中国Miao等建立的重组酶聚合酶扩增(RPA)联合侧流检测试纸条(LFD)快速检测方法，在38 ℃条件下，检测限为100 拷贝/反应，与荧光定量PCR的阳性率符合率为100%[35]。2018年，意大利Biagetti等建立了一种基于生物传感器的嵌合DNA/LNA方法检测猪血液中ASFV DNA。该生物传感器包含锁核酸单链DNA探针，可识别ASFVp72基因保守区，并用qPCR定量方法对该生物传感器进行了校准，检测限达178拷贝/μL，其中，该方法生物素和探针固定需要60 min，之后每个样本检测仅需5 min。对ASFV的检出限达10拷贝/μL，一次最多检测40个样品[36]。Ye等开发的便携式微流控环形荧光探针介导的等温核酸扩增(CFPA)系统，所需阈值时间中位数为10.8 min，检测限为10拷贝/μL，稳定性良好(CV<5%)，临床样品检测显示灵敏度为92.73%，特异性为100%[37]。

在基于PCR原理的多重鉴别诊断方法中，西班牙Aguero等建立并验证了多重RT-PCR方法，可同时鉴别诊断ASFV和CSFV。开发的多重PCR方法检测对5种病毒CSFV、ASFV、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PPRV)和猪细小病毒(PPV)基因，实现了检测方法的高通量，但是其灵敏性受到影响，检测限较单重PCR方法升高了1～2个数量级[38]。英国Haines等建立了同时检测ASFV、CSFV、外源性RNA内控的三重荧光定量PCR方法，对ASFV和CSFV的检测限分别为22个和5个基因组拷贝，临床样品验证显示方法的灵敏性和特异性与标准的普通PCR方法相当，满足临床对2种猪病的鉴别需求[39]。我国科学家建立的多重PCR方法，对CSFV、ASFV、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、PRRSV和伪狂犬病病毒(PRV)的最低检测限分别为1.09×104、1.50×103、2.10×103、1.30×103拷贝/反应和8.97×102拷贝/反应。此外，基于GeXP基因表达谱仪，进一步建立了一种同时检测和鉴别7种猪病原的高通量方法。包括PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、PPV、PCV-2和日本脑炎病毒(JEV)，对每个病原的灵敏性达1 000拷贝/反应[40]。同样，通过建立上述7种病原多重PCR，将PCR产物杂交成微球与探针偶联，再用Bio-Plex悬浮阵列系统进行检测，检出限与基于GeXP基因表达谱仪方法相当。将RT-PCR与自动电子微阵列技术结合，自动完成探针捕获、杂交，清洗和报告，可同时检测猪的7种重要病毒：口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)，猪水疱性疹病毒(VESV)、ASFV、CSFV、PRRSV和PCV-2，其中，对ASFV的检出限达10拷贝/μL。利用xMAP液相芯片技术，将探针与荧光羧化微球偶联，同时检测蓝舌病病毒、鹿的流行性出血热病毒、非洲猪瘟病毒、西尼罗河热病毒等10种虫媒病毒目的基因，灵敏性达10拷贝/μL[41]。2019年，加拿大开发了多重检测工作站，包括了CSFV、ASFV、SVDV、FMDV、水泡性口炎病毒(VSV)，用户只需添加样品和试剂，从核酸提取、多重RT-PCR、反向斑点杂交检测到结果报告，完全实现自动化。整个过程耗时约6 h，可同时处理24个不同组织类型的样品[42]。

在抗体检测方面，俄罗斯通过将ASFV基因CP204L(p30)的中心亲水区克隆到原核载体中，表达高纯度重组p30，诊断特异性为98.75%，敏感性为100.00%。在感染后6～8 d内，可从家猪和野猪采集的免疫系统器官和血清样本中检测到ASFV特异性抗体[43]。在大规模抗体监测方面，由于血清样品腐败变质，常导致基于p30、p54蛋白建立的ELISA方法结果出现假阳性，通过杆状病毒表达系统表达pp62蛋白，建立ELISA方法，提高了检测腐败血清样品的准确性，其原因推测是pp62比p30、p54更大、抗原表位更多，表现的抗原性更强[44]。此外，推荐pB602L和pK205R蛋白表达也可用于ELISA方法检测ASF抗体。Aira等利用液相芯片技术，将ASFV p72和p30蛋白，以及CSFV的E2蛋白分别与微球偶联，相应与市售的抗ASFV或CSFV抗体ELISA试剂盒做比较，发现检测ASFV抗体的灵敏度为97.3%，特异性为98.3%，检测CSFV抗体的灵敏度为95.7%，特异性为99.8%。这种双重检测方法可以同时区分抗ASFV和CSFV的抗体，为监测研究提供了有价值的工具，并有助于与ASF和CSF鉴别诊断[45]。基于ASFV p72蛋白，西班牙INGENASA实验室开发了用于抗原检测的横向流动分析法(LFA)。尽管不如PCR方法敏感，但检测临床样品发现，LFA与ELISA相关性良好，且敏感性高于ELISA，检测限达104HAU。基于此，还进一步开发了能够同时鉴别诊断ASFV和CSFV的双重LFA[46]。2015年，欧盟利用785份临床和试验样本对现有的非洲猪瘟诊断方法进行了评价，结果显示，相比OIE推荐的King等方法，UPL-PCR敏感性更高，在早期检测和对感染康复的猪样本检测方面更具优势。间接免疫过氧化物酶试验(IPT)比ELISAs更敏感，能够在血清学反应的早期检测到ASF抗体。推荐UPL-PCR结合IPT，用于ASF的实验室诊断[47]。

4 思考与展望

自非洲猪瘟2007年传入高加索地区格鲁吉亚，并向欧洲、亚洲蔓延，2010年后，发表的有关非洲猪瘟诊断方法的文章数量也明显增多，从这个角度也反映出非洲猪瘟的全球关注度持续升高。可靠的诊断方法在当前非洲猪瘟防控和国际贸易中发挥着重要作用。可以看到，非洲猪瘟实验室诊断新方法的出现，离不开理化技术的发展、新型仪器设备的开发。与此同时，虽然一些方法，如HAD、FAT、ELISA、IPT、IB，早在20世纪60-90年代就已问世，经过了长期的应用和检验，《OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册》仍将其列为不同情形目的下推荐的诊断方法(表1)。而值得注意的是，手册中显示，至今没有任何一种方法可以适用于评价个体或群体疫苗接种后的免疫状态[48]。

表1 非洲猪瘟实验室检测方法特征

我国生猪养殖场户中99%以上是中小散养户，防疫意识普遍不强，生物安全水平不高，应对非洲猪瘟防范能力较差，难以及时发现并初步判断病情、采取有效控制措施。在未来，需要我们进一步开发、验证、评价、快速的检测方法，来满足现场检测的需求。同时，在确保方法快速、特异、灵敏的前提下，可开发多个病原的高通量检测方法，更好的满足未来养殖、检疫等领域需求。此外，在养殖场日常监测中，利用视频监控、互联网、生物传感器和人工智能等技术，监控并量化分析动物行为和日常活动，实现对动物传染病的实时早期监测，并及时发出预警，同时结合便捷准确的诊断方法，提高非洲猪瘟早期发现的机率。