基于PPAR-γ激动剂的四妙勇安汤活性部位筛选及其化学成分分析

李慧 杨会 白云绮

[摘要] 目的 筛选四妙勇安汤具有过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）激活作用的活性部位，并对其化学成分进行分析，探讨提取物的活性成分和抗炎作用。 方法 采用醇水提取、树脂分离获得四妙勇安汤的8个提取物，以PPAR-γ为靶点，于细胞水平筛选四妙勇安汤提取物的活性部位，对有活性趋势的提取物绘制剂量依赖性曲线，计算EC50值以及相对活性，并采用液相色谱-串联质谱法对活性部位的化学成分进行分析鉴定。 结果 PPAR-γ激动模型中，提取物CS04及CS05具有较强的PPAR-γ激活作用。对活性部位CS04和CS05进行化学成分鉴定，共鉴别出31个成分。 结论 四妙勇安汤提取物CS04和CS05具有较强激活PPAR-γ作用，这一作用可能与其抑制动脉粥样硬化炎症有关。

[关键词] 四妙勇安汤提取物;过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂;激活作用;化学成分;液质联用技术

[中图分类号] R286.0          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（a）-0028-06

[Abstract] Objective To screen the active parts of Simiao Yong′an Decoction with peroxisome proliferators-activated receptor γ （PPAR-γ） activation and analyze its chemical components， and to explore the active components and anti-inflammatory effects of the extract. Methods Eight alcohol extracts of Simiao Yong′an Decoction were obtained by alcohol extraction and resin separation. The PPAR-γ was used as the target to screen the active parts of the extract of Simiao Yong′an Decoction at the cell level. A dose-dependent curve was drawn for the extracts with active tendency. EC50 value and relative activity value were calculated， and the chemical composition of active parts was analyzed and identified by liquid chromatograph-tandem mass spectrometer technology. Results In the PPAR-γ activation model， the extracts CS04 and CS05 have strong PPAR-γ activation. The chemical components of the active parts CS04 and CS05 with strong PPAR-γ agonistic effects were identified. A total of 31 components were identified. Conclusion CS04 and CS05 of Simiao Yong′an Decoction have strong PPAR-γ activation， which may be related to the inhibition of atherosclerosis inflammation.

[Key words] Simiao Yong′an Decoction; Peroxisome proliferators-activated receptor γ agonist; Activity screening; Chemical composition; Liquid chromatograph-mass spectrometer

動脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的重要病理基础，由其引起的心血管疾病已成为我国最主要的致死和致残的疾病之一[1]。AS发病机制较为公认的是慢性血管炎症学说[2-3]。近年来，研究显示[5-6]PPAR-γ是炎性反应和细胞增殖的调节剂，能够对炎症介质进行负反馈调节[4]，减少单核/巨噬细胞炎症基因的表达，减轻免疫和炎性反应[7]，从而延缓AS发展，稳定斑块，防止破裂。

四妙勇安汤由金银花、玄参、当归和甘草组成，广泛用于治疗以AS为病理基础的多种血管病变，临床疗效显著[8-9]。研究显示[12]，四妙勇安汤可以通过活化斑块内PPAR-γ的表达，有效减少多种炎性因子释放[10-11]，抑制核转录因子κB（NF-κB）表达，控制AS炎性反应，增强斑块的稳定性。本研究以PPAR-γ为靶点筛选四妙勇安汤提取物，并对活性部位化学成分进行分析，旨在为阐明发挥抗AS炎症的物质基础及深入探讨其药理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100 series HPLC system（美国Agilent公司），包括二元泵、在线脱气机、自动进样器和DAD检测器;Agilent 6320 Ion Trap XCT型离子阱质谱仪（美国Agilent公司）;水套式二氧化碳细胞培养箱（日本Sanyo公司）;EnSpireTM 2300 Multilabel Reader（美国PerkinElmer公司）。

非洲绿猿猴肾细胞（CV-1，中国科学院上海细胞种质库提供），PPRE质粒、PPAR-γ质粒、RXRα质粒均由中国科学院上海药物研究所提供，DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），Bright-Glo Luciferase荧光素酶检测试剂（美国Promega公司），罗格列酮[葛兰素史克（天津）有限公司]。对照品：绿原酸（110753-200413）、木犀草苷（111720-200905）、哈巴苷（111729-200603）、哈巴俄苷（111730-200605）、甘草苷（111610-201005）和甘草酸铵（110731-200615）均购自中国食品药品检定研究院。标准药材金银花（121060-200906）、玄参（121008-200906）、当归（120927-201014）、甘草（121303-200502）购自中国食品药品检定研究院。试验用药材金银花、玄参、当归、甘草由北京康仁堂药业有限公司提供并鉴定。乙腈为色谱纯（德国Merck公司）;超纯水由Milli-Q系统制备（美国Millipore公司）;其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂厂。

1.2 方法

1.2.1 样品提取与制备

取金银花90 g、玄参90 g、当归60 g、甘草30 g，加8倍量55%乙醇水溶液提取4次，每次2 h，得到醇提液和残渣，回收醇提液浓缩至干，加水混悬，采用AB-8型大孔树脂分离，依次用纯水，30%、60%和95%乙醇淋洗至流出液澄清，获得上述4个部位，分别减压浓缩干燥，得到筛选样品CS02～CS05号;将残渣用水提取2次，每次1.5 h，得到水提液，浓缩至干，留取样品CS01号;其余样品加水混悬，采用AB-8型大孔树脂分离，依次用纯水，55%、95%乙醇淋洗至流出液澄清，获得以上3个部位，分别减压浓缩干燥，得到筛选样品CS06～CS08号。

1.2.2 CV-1转染及荧光素酶基因表达水平检测

将CV-1用含有10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM培养基在37°C，5%CO2培养箱中培养，将生长状态良好的细胞每3天传代，使细胞的状态和密度均达到最佳状态。

将含有PPAR靶序列反应元件的PPRE荧光素酶报告基因质粒、PPAR-γ以及RXRα质粒共转染入CV-1中。转染24 h后，以每孔3×104个细胞接种至24孔板，每孔500 μL。4 h后，加入阳性对照药罗格列酮20 μmol/L以及待测提取物CS01～CS08，在37°C，5% CO2培养箱中培养24 h后检测荧光素酶基因表达水平。初筛时，提取物均以1 mg/mL作为初筛起始浓度，10倍稀释，得到1.00、0.10、0.01、0.001 mg/mL共4个浓度;复筛时，选取初筛有活性趋势的提取物绘制剂量依赖性曲线，计算EC50值以及相对活性。

1.2.3 活性部位化学成分的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析鉴定

1.2.3.1 供试品溶液的制备  精密称取活性部位CS04 5.5 mg，CS05 5.1 mg置容量瓶中，加50%乙腈水定容至5 mL得供试品溶液。

1.2.3.2 对照品溶液的制备  精密称取甘草苷0.8 mg、木犀草苷1.0 mg、绿原酸2.4 mg、哈巴苷2.0 mg、哈巴俄苷0.9 mg和甘草酸铵0.7 mg，混合后用50%乙腈水定容到10 mL。将各对照药材粉碎过筛，取0.1 g置5 mL容量瓶，用50%乙腈水定容。

1.2.3.3 色谱条件  色谱柱：Agilent ZOBAX SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min：5%～10% B;5～18 min：10%～17% B;18～25 min：17%～20% B;25～40 min：20%～35% B;40～80 min：35%～80% B）;柱温：30°C;流速：1.0 mL/min;进样量：5 μL;检测波长：256、280、360 nm。

1.2.3.4 质谱条件  柱后分流比为1∶4，20%洗脱液进入离子源。离子源参数如下：负离子检出模式;毛细管温度：350°C;毛细管电压：3500 V;夹套气（N2）流速：10 L/min;辅助气（N2）压力：30 psi。质谱仪全扫描范围m/z：100～1200。氦气为碰撞气体，实验过程中碰撞能量自动选择。

2 结果

2.1 活性部位筛选结果

以20 μmol/L罗格列酮所诱导的细胞基因活性为100%，提取物在1 mg/mL时相对活性以及EC50（mg/mL），四妙勇安汤不同部位提取物对PPAR-γ表达的促进作用。见表1。

2.2 活性部位化学成分分析

采用LC-MS/MS技术，从CS04、CS05两个活性部位中共鉴定31个成分，对31个成分进行药材来源的归属[13-16]。结果见图1～2、表2～3。

3 讨论

近年来，研究显示[17-19]，PPAR-γ在AS易损斑块的形成发展过程中发挥重要作用，PPAR-γ已经成为防治心血管疾病的新靶点[20]。课题组前期研究显示[21]：四妙勇安汤作为中医解毒活血法的代表方，可以抑制多种血清炎性因子表达;动物实验显示其可提高斑块内PPAR-γ的表达，抑制AS炎性反应，防止斑块破裂，但其发挥药效的物质基础不明确。因此，本研究制备了四妙勇安汤不同极性的提取物CS01～CS08，以PPAR-γ为靶点于细胞水平筛选出具有较强激活PPAR-γ功能活性部位，并鉴定了其化学成分。

本研究发现罗格列酮所诱导的报告基因活性为100%，在建立的PPAR-γ激动模型中，四妙勇安汤CS04提取物在0.1 mg/mL时相对活性为100%，CS05提取物在0.01 mg/mL时相对活性为90%，在10～4 mg/mL到10～1 mg/mL浓度范围内呈现剂量依赖。与阳性对照药物罗格列酮比较，两种提取物促进PPAR-γ表达的相对活性与罗格列酮相当，提示CS04和CS05对PPAR-γ具有明显的激活作用，因此筛选出四妙勇安汤提取物CS04和CS05两个活性部位。

基于两个活性部位的PPAR-γ激动作用，进一步对CS04及CS05所含化学成分采用LC-MS/MS技术进行了快速的鉴别分析。共鉴定出31种成分，对所鉴别的各成分进行归属，来源于金银花3种，玄参1种，当归1种，甘草26种，主要有黄酮类成分22个（来源于金银花、甘草）、有机酸2个（主要来源于金银花）、环烯醚萜1个（主要来源于玄参）、皂苷1个（主要来源于甘草）、香豆素5个（主要来源于甘草、当归），其中黄酮类成分居多且大部分成分来自甘草。

课题组前期动物实验显示[21]：四妙勇安汤可通过提高斑块内PPAR-γ的表达，从而抑制AS炎性反应。本研究从活性筛选角度，进一步筛选获得了2个具有较强激活PPAR-γ的活性部位，并进行了成分鉴别，初步确定了该方的活性成分，为课题组深入系统阐明四妙勇安汤抗AS确切的活性成分及抗炎机制研究奠定基础。

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（收稿日期：2019-11-15  本文编辑：刘永巧）