miR-4472的靶基因预测及生物信息学分析

刘珏 陈星光 朱雯 侯秋英 张旭 沈方方 滕懿群

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是一种严重的中枢神经系统疾病，其病情重、病死率高、预后差，部分患儿会留下脑瘫、智力发育低下、癫痫等神经系统后遗症[1]。加上目前尚无HIE诊断的金标准，临床治疗亦缺乏特异性，总体疗效欠佳。微小RNA（microRNA，miRNA)是一类内源性非蛋白质编码的小分子RNA，可参与诸多生命过程并发挥重要的生物学作用，是当前生命科学领域的研究热点[2]。笔者所在团队前期研究已通过芯片检测筛选出HIE相关miRNA，同时应用RT-PCR法验证差异表达明显的miRNA，结果显示HIE患儿血浆中miR-4472表达水平明显升高，miR-4472可能是预测HIE预后的生物标志物[3]，但其相关调控机制尚未明确。为此，本研究拟应用生物信息学分析方法预测miR-4472的靶基因及信号通路，为miR-4472在HIE发生、发展中的调控机制研究提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 miR-4472的物种保守性分析 利用miRBase数据库（http://www.mirbase.org）检索miRNA序列，分析其物种保守性。

1.2 miR-4472的靶基因预测 通过Targetscan（http://www.targetscan.org）、miRDB（http://mirdb.org）、miRTar－Base（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）靶基因数据库在线预测miR-4472的靶基因，对3者结果进行venny图构建，得到交集靶基因。

1.3 miR-4472预测靶基因的生物功能及信号通路富集分析 应用DAVID数据库，将miR-4472的预测靶基因集合进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物通路富集分析。GO分析包括细胞组分、分子功能及生物过程等3个部分，P＜0.01为差异有统计学意义。采用Fisher确切概率法统计基因集合相对背景生物通路的P值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-4472的物种保守性分析 利用miRBase数据库在线检索人类、小鼠、大鼠、猕猴等各物种的miRNA序列进行对比，发现miR-4472序列“GGUGGGGGG UGUUGUUU”在各物种间高度保守。

2.2 miR-4472的靶基因预测 Targetscan、miRDB、miRTarBase等3个靶基因数据库结果显示，miR-4472靶基因分别有 4 943、418、179个；3者交集靶基因仅35个，不能用于数据的统计分析。因此，笔者选取Targetscan、miRDB等2个数据库的结果交集，显示共有378个预测靶基因。

2.3 miR-4472预测靶基因的生物功能及信号通路分析 将预测的378个交集靶基因通过DAVID数据库进行GO功能富集分析和KEGG生物通路富集分析。GO分析结果显示，miR-4472靶靶基因富集在基底外膜、核染色质、突触囊泡膜、突触后致密物、异染色质等细胞组件，参与转录因子活性、DNA结合、蛋白连接酶结合等分子功能，涉及转录的正负调节、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等生物过程，见表1～3。KEGG信号通路分析结果显示，miR-4472的靶基因信号传导显著富集于PI3K-Akt信号通路、胰高血糖素相关信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导通路、醛固酮的合成和分泌相关信号通路，见表4。

3 讨论

自1993年科学家发现第一个miRNA（lin-4）以来，对关于miRNA功能的细胞生物学、遗传学及临床各学科研究成为近年来的热点之一[4]。越来越多证据表明，miRNA可在转录后水平调控基因表达，广泛参与细胞增殖、分化以及凋亡等多种过程，同时研究证实其在缺血性脑卒中、帕金森病、肿瘤、阿尔茨海默病等多种神经系统性疾病中发挥重要作用[5-7]。笔者前期研究发现，HIE患儿血浆中miR-4472表达水平明显升高，miR-4472可能是预测HIE预后的生物标志物[3]，但其相关调控机制尚不明确。因此，本研究首先通过miRBase数据库对miR-4472物种的序列保守性进行在线分析，检索发现其在多个物种中呈高度保守，说明在进化过程中这一段特殊序列在不同物种中均被完整保存下来，提示在功能研究方面有一定的价值，可能具有重要的生物学功能。再利用Targetscan、miRDB等靶基因数据库进行预测，分析miR-4472可能的生物学功能，结果发现其生物过程主要在轴突发生的负调节、转录、转录的正负调节、DNA模板、细胞凋亡、蛋白质磷酸化等方面，提示miR-4472可能在神经细胞的周期调控、细胞凋亡等方面具有重要作用。

表1 miR-4472预测靶基因的细胞组分

表2 miR-4472预测靶基因的分子功能

表3 miR-4472预测靶基因的生物过程

表4 miR-4472预测靶基因的KEGG信号通路分析

在KEGG信号通路分析结果中，值得注意的是miRNA-4472的靶基因显著富集于P13K/Akt信号通路。P13K/Akt信号通路作为经典的抗凋亡通路，又被称为再灌注损伤救援激酶途径。当该信号通路被激活时，可通过调节下游凋亡相关靶蛋白和靶基因抑制神经细胞凋亡，进而发挥脑保护作用，但确切作用机制并未完全清楚[8-9]。有研究构建了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，发现当神经元缺氧缺血时可激活P13K/Akt信号通路，诱导缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白表达增加，并认为P13K/Akt信号通路可能是HIE治疗的新靶点[10]。miRNA不论是通过经典还是非经典的作用途径，最终都是在转录、翻译过程中下调靶蛋白的表达量，往往与靶基因的作用相反[11]。以上结果提示miRNA-4472可能通过抑制P13K/Akt信号通路相关基因如CREB、PRLR及G6PC2等的表达，加重脑损伤并增加远期神经系统后遗症发生的风险。HIE患儿除典型脑病症状外，缺氧持续存在，时常伴有全身多个脏器的损伤、电解质紊乱、血糖异常等[12]。生物信息学分析结果显示，miR-4472的靶基因亦富集于胰高血糖素相关信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导通路及醛固酮的合成和分泌相关信号通路，说明miR-4472表达不仅与HIE患儿神经系统损害程度有关，也可能在心肌细胞功能、电解质及血糖调控方面产生影响。

综上所述，本研究应用生物信息学分析方法预测了miR-4472的靶基因及信号通路，发现靶基因富集的信号通路均与HIE密切相关，尤其是P13K/Akt信号通路。后期将以此理论及实验为基础，进一步探究miR-4472在HIE发生、发展过程中的调控机制。