油樟叶精油的提取、化学成分、抗氧化以及抗菌活性研究

尹 浩，王晨笑，岳 进 ，焦顺山, ，王小红，蒋磷蕾 ,*

（1.上海交通大学食品科学与工程系，上海 200240；2.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240；3.农业农村部都市农业重点实验室，上海 200240；4.四川宸煜林业开发有限责任公司，四川 宜宾 644000）

油樟（Cinnamomum longipaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li）是樟科樟属常绿乔木，特产于四川和陕西[1]。樟油是从油樟树中提取出的挥发性植物精油，实际生产中以从树叶中提取为主。油樟叶中的挥发油含量为3.8%～4.5%[2]，主要由萜类化合物组成，主要成分为1,8-桉叶素和松油醇[3]。油樟油是一种重要的化工原料，其广泛应用于医药、食品等领域[4]。目前，对油樟油及其主要成分的研究主要集中在抑菌[5-6]、杀虫[7]、消炎镇痛[8-10]、抗氧化[11]和抗癌[12]等活性方面，对透皮渗透[13]、胃保护[14]、减少黏液分泌[15]等方面也有少量研究。

酶辅助提取是指通过酶的作用破坏细胞结构，使得被提取物从细胞中更易释放而被提取，具有效率高、操作简便和条件温和等优点[16]，目前被广泛应用于生物活性物质的提取。同时蒸馏萃取法是指通过同时把样品和有机溶剂加热至沸腾，使得蒸馏和萃取过程同时进行，从而提高提取收率[17]，目前也被广泛应用于食品分析、香精香料等领域[18]。超临界流体萃取是指利用超临界流体所具有的类似于气体的强穿透力和类似于液体的密度和溶解性来进行萃取，其具有条件温和、无毒无害和高效等优点[19]。

目前樟油的工业生产主要使用传统的水蒸气蒸馏方法，收率为1.5%～2.0%，远低于油樟叶中挥发油实际含量[20]，低产率严重制约着我国油樟产业的发展。目前对樟油提取的研究主要集中在对水蒸气蒸馏等传统提取方法的改进和提升。邓梅等[21]用索氏提取法提取樟油，出油率可达2.06%；周诰均等[22]研究了不同的水蒸气蒸馏方式对樟油收率的影响，发现水上蒸馏提取率最高，可达3.83%；Chen 等[23]将微波辅助水蒸气蒸馏与溶剂萃取串联使用，樟油收率可以达到3%以上。将酶辅助提取、同时蒸馏萃取、超临界流体萃取等方法应用于油樟油的提取鲜有报道。本研究采用酶辅助溶剂萃取法（EASE）、酶辅助水蒸气蒸馏法（EASD）、酶辅助同时蒸馏萃取法（EASDE）和超临界流体萃取法（SFE）从油樟树叶中提取樟油，对精油进行气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析，并对其清除DPPH 自由基活性和抗菌活性进行研究，以期为樟油产业的升级和樟油精深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

油樟树叶于2017 年12 月采于四川宜宾，自然晾干后备用。

大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为上海交通大学食品加工与包装实验室保存菌种。

纤维素酶（Cellulase），上海麦克林生化科技有限公司产品；石油醚（Petroleum ether），上海泰坦科技股份有限公司产品；正戊烷（n-pentane），阿拉丁试剂（上海）有限公司产品；无水乙醚（ethyl ether absolute）、无水硫酸钠（sodium sulfate anhydrous）、无水乙醇（ethyl alcohol absolute），均为上海凌峰化学试剂有限公司产品；吐温-80（tween-80），国药集团化学试剂有限公司产品；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），Sigma-Aldrich 公司产品；以上试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

NW10VF 型超纯水系统，JP-500C 型粉碎机，2875 型水浴锅，Multiskan GO 型酶标仪，IMP180 微生物培养箱，420 型恒温摇床，RE-52AA 型旋转蒸发器，HA120-50-01 型超临界二氧化碳萃取装置，PL2002 型电子天平，7890A-5975C 型气相色谱质谱联用仪，ZNHW-Ⅱ型智能恒温电热套，DCW-4006 型低温恒温槽。

1.2 方法

1.2.1 樟油提取

将油樟叶于室温下晾干至含水量低于5%，用粉碎机粉碎，过 20 目筛[24]。

1.2.1.1 酶辅助溶剂萃取

称取200 g 油樟叶粉置于5 L 烧杯中，加入0.6%的纤维素酶（10 000 U/g）和2 000 mL 去离子水（料液比 1∶10（g/mL））[25]，45 ℃水浴 1 h，并不断搅拌，使油樟叶充分酶解。过滤，滤液和滤渣分别以石油醚萃取3次[26]。合并有机溶剂，往里加入1 g 无水硫酸钠静置24 h 脱水，过滤后将滤液旋转蒸发去除溶剂得到粗樟油，称重后计算收率并置于冰箱保存备用[22]。

油樟叶精油收率计算公式：

1.2.1.2 酶辅助水蒸气蒸馏

称取150 g 油樟叶粉置于3 L 圆底烧瓶中，加入0.6%纤维素酶（10 000 U/g）和 1 500 mL 去离子水（料液比 1∶10（g/mL）），45 ℃下水浴 1 h，并不断搅拌，使油樟叶充分酶解。加热使混合物沸腾，有馏出物滴下时开始计时，蒸馏2 h 后停止加热，收集馏出物上层油状液体，往里加入1 g 无水硫酸钠静置24 h 脱水得到粗樟油，称重后计算收率并放入冰箱保存备用，收率计算公式同上。

1.2.1.3 酶辅助同时蒸馏萃取

称取150 g 油樟叶粉置于3 L 圆底烧瓶中，加入0.6%纤维素酶（10 000 U/g）和1 500 mL 去离子水（料液比 1∶10（g/mL）），45 ℃水浴 1 h，并不断搅拌，使油樟叶充分酶解。以戊烷和乙醚（体积比1∶1.2）作溶剂[27]，35 ℃水浴加热有机溶剂，等U 型管内开始有有机溶剂回流时，加热混合物使其沸腾，同时蒸馏萃取2 h，试验装置如图1 所示，收集有机相，往里加入1 g 无水硫酸钠静置24 h 脱水，过滤后将滤液旋转蒸发去除溶剂得到粗樟油，称重后计算收率并放入冰箱保存备用，收率计算公式同上。

1.2.1.4 超临界二氧化碳萃取

称取200 g 油樟叶粉置于超临界装置萃取筒中，开启加热开关对萃取釜、分离釜I 和分离釜II 进行预热，当达到设定温度时，打开CO2阀门，启动泵加压，调节萃取釜压强使其到达预定压强，对油樟叶中樟油进行萃取，萃取约30 min 后从分离釜I 处已无法接到萃取物，萃取结束。试验条件为萃取釜温度40 ℃，分离釜I 和分离釜II 温度均为60 ℃，萃取釜压强10 MPa，分离釜I 和分离釜II 压强均为5 MPa[24]。收集萃取物，称重后计算收率并放入冰箱保存备用，收率计算公式同上。

以上所有提取方法均重复3 次。

1.2.2 樟油成分分析

1.2.2.1 精油处理

将酶辅助溶剂萃取法、酶辅助水蒸气蒸馏法和酶辅助同时蒸馏萃取法提取得到的油樟叶精油均用正己烷稀释 100 倍，取 1 μL 进行 GC-MS 分析。

准确称取50 mg 超临界流体萃取得到的油樟叶精油于1.5 mL 进样瓶中，加入正己烷和无水乙醇（体积比 1∶1）1 mL 振荡使其溶解，0.22 μm 微孔滤膜过滤后，进行GC-MS 分析。

1.2.2.2 GC-MS 分析条件

色谱条件：色谱柱 DB-5 毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），进样量 1 μL，分流比 5∶1；程序升温为 50 ℃保持 3 min，5 ℃/min 升温至 240 ℃，20 ℃/min 升温至300 ℃保持 5 min。

质谱条件：电子电离（Electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度 150 ℃，质量扫描范围（m/z）33～500，扫描速率0.8 s/全程。

1.2.2.3 定性和定量分析

对4 种樟油进行GC-MS 联用分析，采集得到的总离子流图中各质谱图，利用NIST 库检索，同时采用保留指数和参考文献来辅助质谱检索定性；定量分析结果依据总离子流色谱峰的峰面积归一化法来计算各组分的相对含量。

用于测定保留指数的正构烷烃系列标准样品为C8-C16，计算公式为：

式中：I为待测物的程序升温保留指数；tn和tn+1分别为含n、n＋1 个碳的正构烷烃的保留时间；tx为待测物的保留时间。

1.2.3 樟油抗氧化活性的测定

参考丛赢等[9]的方法，略作改动。取DPPH·39.43 mg溶于1 000 mL 溶剂无水乙醇中（0.1 mmol/L），充分振摇使其完全溶解。配制不同浓度梯度的樟油无水乙醇溶液，浓度分别为 0.157、0.313、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL，以抗坏血酸作为阳性对照。分别取0.1 mL 樟油溶液与3.9 mL 上述DPPH·无水乙醇溶液混合，室温下避光反应30 min，测定混合液在516 nm 的吸光值。以无水乙醇为空白样，平行测定3次，结果取平均值。DPPH 自由基清除率按下式计算：

式中：A0为 DPPH·溶液吸光值；At为待测样品与DPPH·反应tmin 后的吸光值。

1.2.4 樟油最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（Minimum bactericidal concentration,MBC）测定

菌悬液的制备：将细菌菌种活化，制成菌悬液。采用平板计数法测细菌浓度，调至浓度104～105CFU/mL，备用。

将樟油以吐温80 为乳化剂，灭菌的肉汤培养基为溶剂配制成64 μL/mL 的母液，用直径0.22 μm 的无菌滤器过滤除掉配制过程中可能引入的杂菌[28]，以二倍稀释法将其依次稀释至 64、32、16、8、4、2、1、0.5 μL/mL。选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为受试菌种，向试管中加入2 mL 不同浓度的樟油肉汤培养基溶液和 20 μL 菌悬液（104～105CFU/mL），37 ℃下160 r/min 振荡培养24 h，以未加入菌悬液的樟油肉汤培养基溶液作为对照组，测定在540 nm 处的吸光值A540nm。与对照组相比OD 值变化小于0.05[29]的培养基视为无细菌生长，其含有樟油的浓度即为最低抑菌浓度（MIC）[30]。

取樟油MIC 以上未见细菌生长的培养物每管各0.1 mL，采用预加菌液倾注平板法接种至营养琼脂平板，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，观察细菌生长状况，没有细菌生长的最低浓度即为最低杀菌浓度（MBC）[28]。

1.2.5 数据处理

采用SPSS 软件对油樟叶精油的收率进行ANOVA方差分析，结果以平均值±标准差表示，采用Duncan’s法进行多组样本间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 樟油的收率和物理性质

由表1 可见，4 种提取方法的油樟叶精油收率有显著性差异，EASDE 法的收率最高，达到3.70%，EASD和SFE 法次之，分别为3.00%和2.29%，EASE 法最低，只有1.36%。与EASD 法相比，EASDE 法多了萃取的环节，可以将水相中溶解的樟油提取出来，因而收率最高。而SFE 法由于萃取压强较高，导致萃取出的低沸点物质减少，高沸点物质增加，无法将油樟叶中大量存在的低沸点单萜类物质萃取出来，所以樟油收率较低[24]。EASE 法的樟油收率最低，是萃取前对样品进行过滤以及滤渣萃取不完全导致，单独使用溶剂萃取并不适用于提取樟油。

表1 不同提取方法下油樟叶精油的收率及主要物理性能Table 1 The yield and physical properties of Cinnamomum longipaniculatum essential oils obtained by different extraction methods

从提取时间上看，EASE 法约需2 h，而EASD 和EASDE 法由于需要蒸馏，提取时间可达4 h 以上，是几种方法中最耗时耗力的；SFE 法虽然樟油收率较低，但相比前几种方法省去了酶解、蒸馏和去溶剂的操作，提取一次仅需30 min 左右，是4 种方法中效率最高的。

EASE 法提取的樟油为墨绿色油状液体，墨绿色是叶绿素等绿色物质溶于有机溶剂被萃取所致，樟油具有樟叶特有的香气，且1,8-桉叶素气味明显。EASD法得到的樟油为无色澄清油状液体，樟叶香气明显，且气味较纯净。EASDE 法提取的樟油同样是澄清油状液体，微黄，具备樟叶特有香气，且1,8-桉叶素气味明显。SFE 法提取的樟油为棕红色膏状固体，60 ℃下可融化，散发出浓郁的樟叶香气，并伴随一些杂味。

2.2 樟油化学成分分析

按上述试验条件对4 种方法提取出的油樟叶精油的化学成分进行测定分析，得到总离子流色谱图，如图2 所示。采用NIST 库检索质谱和保留指数结合的二维定性法，定性结果及相对含量见表2，其中相对百分含量由峰面积归一化法计算所得。

表2 不同方法提取的油樟叶精油中化学成分的GC-MS 鉴定结果及各化合物的相对含量Table 2 Identification results and relative contents of main chemical components from essential oil of Cinnamomum longipaniculatum obtained by different extraction methods

续表2 不同方法提取的油樟叶精油中化学成分的GC-MS 鉴定结果及各化合物的相对含量Continue table 2 Identification results and relative contents of main chemical components from essential oil of Cinnamomum longipaniculatum obtained by different extraction methods

由表 2 可以看到，采用 EASE、EASD、EASDE、SFE 提取的樟油中萜类化合物较多，以单萜和倍半萜类为主。EASE 法所得挥发油共鉴定出37 种化合物，占精油总量的95.74%，其中有单萜类化合物20 种（54%），倍半萜类化合物16 种（43%），其他类化合物1 种（3%）。提取物的主要成分为1,8-桉叶素（53.38%）、α-松油醇（24.02%）、桧烯（5.37%）、4-萜烯醇（2.67%）、顺-4-侧柏醇（2.48%）和δ-松油醇（2.07%）。EASD 法所得挥发油共鉴定出54 种化合物，占精油总量的98.40%，其中有单萜类化合物24 种（44%），倍半萜类化合物28 种（52%），其他类化合物2 种（4%）。主要成分有 1,8-桉叶素（38.34%）、α-松油醇（16.76%）、桧烯（9.38%）、4-萜烯醇（6.08%）、α-蒎烯（4.86%）和β-蒎烯（3.77%）。

EASDE 法提取的挥发油共鉴定出26 种化合物，占精油总量的99.66%，其中有单萜类化合物20 种（77%），倍半萜类化合物6 种（23%）。主要成分有1,8-桉叶素（54.05%）、桧烯（9.95%）、α-蒎烯（7.82%）、γ-松油烯（6.22%）、β-蒎烯（5.80%）和 α-松油烯（4.46%）。

SFE 法提取的挥发油共鉴定出29 种化合物，仅占精油总量的53.69%，其中单萜类化合物12 种（41%），倍半萜类化合物15 种（52%），其他类化合物2 种（7%）。主要成分有 1,8-桉叶素（30.24%）、桧烯（5.71%）、石竹烯（4.46%）、α-松油醇（3.94%）。

从挥发油的成分和种类来看，4 种方法的提取物含有16 种共有成分，主要成分为1,8-桉叶素。酶辅助溶剂萃取（EASE）和酶辅助同时蒸馏萃取（EASDE）法提取的樟油1,8-桉叶素含量显著高于其他两种方法，分别为53.38%和54.05%；酶辅助溶剂萃取（EASE）法提取的樟油α-松油醇含量最高，达到24.02%。酶辅助溶剂萃取（EASE）、酶辅助水蒸气蒸馏（EASD）和酶辅助同时蒸馏萃取（EASDE）法提取物成分相近，主要为单萜类化合物如蒎烯、桧烯、1,8-桉叶素和α-松油醇等。此外还含有多种倍半萜类化合物以及少量酯类化合物。而超临界流体提取物中，单萜类化合物含量仅为43.74%，其中1,8-桉叶素的含量为30.24%。倍半萜类及其他高沸点化合物占大多数，所以提取物在常温下为固态。

2.3 樟油抗氧化活性分析

DPPH 自由基是一种有机自由基，其结构中含有3 个苯环，1 个N 原子上有一个孤对电子，其乙醇溶液呈深紫红色，并在515～529 nm 范围内有最大吸收峰，当向DPPH 自由基溶液加入自由基清除剂后，其孤对电子被配对，紫红色的DPPH 自由基被还原成浅黄色的DPPH-H 非自由基形式，且褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可以用来表征待测物的抗氧化活性。4 种方法提取出油樟油的DPPH 自由基清除能力见图3。

由图3 可以看出，DPPH 自由基的清除率与浓度相关，随着浓度增大，油樟油的DPPH·清除率均提高。4 种方法提取出的樟油的DPPH·清除率存在一定差异，超临界流体萃取的樟油DPPH·清除率高于其他三种樟油，抗氧化活性最强，原因可能是其成分中含有较多的高沸点化合物，具备较强的自由基清除能力。酶辅助溶剂萃取次之，而酶辅助水蒸气蒸馏和酶辅助同时蒸馏萃取法提取的樟油DPPH·清除率很低，几乎不具备抗氧化性。与VC 阳性对照组相比，4种方法提取出的樟油在受试浓度下DPPH·清除率远低于VC，可见樟油的抗氧化能力较弱。

2.4 樟油抗菌活性分析

表3 展示了4 种樟油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 和MBC。酶辅助溶剂萃取、水蒸气蒸馏和同时蒸馏萃取法提取得樟油的抗菌活性相近，3 种樟油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌活性（MIC=8 μL/mL），而在杀菌方面，三种樟油对大肠杆菌的MBC（8 μL/mL）要低于金黄色葡萄球菌的MBC（16 μL/mL），说明樟油杀灭金黄色葡萄球菌的能力比杀灭大肠杆菌的能力弱；而超临界流体萃取的樟油抗菌性较差，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为32、16 μL/mL，最低杀菌浓度分别为64、32 μL/mL，原因是樟油中1,8-桉叶素和松油醇等具有抗菌性的物质含量较低。

表3 4 种樟油的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）Table 3 The MIC and MBC of four kinds of Cinnamomum longipaniculatum essential oils 单位：μL/mL

3 结论

本研究使用酶辅助溶剂萃取法、酶辅助水蒸气蒸馏法、酶辅助同时蒸馏萃取法和超临界流体萃取法从油樟树叶中提取樟油，并结合GC-MS 分析了油樟油的主要成分。结果表明，酶辅助同时蒸馏萃取法的收率最高，达到了3.70%，与传统水蒸气蒸馏相比极大地提高了油樟精油的收率。不同提取方法对樟油成分的影响较大，但主成分均为1,8-桉叶素。酶辅助同时蒸馏萃取法和酶辅助溶剂萃取法提取物中1,8-桉叶素含量超过50%。

4 种提取法提取的樟油其DPPH·清除率均显著低于VC，超临界流体萃取提取的樟油DPPH·清除率最高；酶辅助溶剂萃取、酶辅助水蒸气蒸馏和酶辅助同时蒸馏萃取提取的樟油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抗菌效果，但超临界流体萃取提取的樟油对两种菌的抗菌效果均较差。

综上所述：酶辅助同时蒸馏萃取法最适用于油樟油的提取；油樟油可以作为一种天然抑菌物质，在食品、医药领域有广泛的发展与应用潜力。