超临界CO2 对哈密瓜汁中大肠杆菌的杀灭效果研究

侯思涵，陈计峦，裴龙英，李文新

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003）

新疆是哈密瓜主要种植区。由于产区多分布在南北疆，远离内地市场，鲜瓜运输和贮藏期间损耗很大，每年因腐烂变质造成的损失达到25%～30%。因此，亟需开发哈密瓜保值增值技术，其中哈密瓜汁饮料是最具潜力的哈密瓜加工产品。哈密瓜是热敏性水果，在热杀菌过程中会产生大量的热臭异味，严重影响了哈密瓜汁的正常风味，哈密瓜在国际上还没有成为果汁工业化生产的主要原料。因此，采用新型杀菌方法最大程度地保持哈密瓜汁原有风味便成为哈密瓜汁加工生产中急需解决的问题。

超临界二氧化碳（SCCO2）是廉价无毒的天然杀菌剂，能有效的杀灭微生物[1-5]，是一项绿色环保的非热力杀菌技术。超临界CO2技术不仅能有效杀灭食品中的腐败微生物和病原微生物，还能保持食品的色泽、风味和营养成分，克服热力杀菌造成的营养成分损失和热臭气味的产生。近年来，国内外利用超临界二氧化碳对果蔬进行灭菌已有文献报道，但对哈密瓜汁采用超临界CO2技术进行杀菌的报道极少[6]。

本试验采用超临界CO2对哈密瓜汁进行处理，以哈密瓜汁中大肠杆菌为研究对象，研究超临界CO2对哈密瓜汁中大肠杆菌的杀灭效果，结合细胞超微结构的观察和分析，探讨超临界CO2的杀菌机理，为哈密瓜汁等果蔬汁加工及超临界CO2的产业化应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

哈密瓜：购于石河子农贸市场，新鲜饱满，成熟度均匀，可溶性固形物含量9%～11%。

哈密瓜汁：哈密瓜清理，去皮，去籽，切成2～3 cm的小块，榨汁后用4 层纱布过滤两次，用无菌瓶分装，在4 ℃保存备用；

大肠杆菌菌种：石河子大学食品微生物实验室提供。

培养基：营养琼脂培养基，营养肉汤培养基。

试剂：K2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaCl、乙醇、戊二醛、环氧树脂、丙酮、醋酸铀均为分析纯；二氧化碳纯度为99.9%。

1.1.2 仪器与设备

219A-1171 型超薄切片机，H-600 型透射电镜，超临界设备（天津市华泰森淼生物工程技术有限公司HPP.L.2-600/0.6），电热培养箱，打浆机，高速冷冻离心机，精密电子天平，生化培养箱，电子天平，灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌菌悬液的制备

汉晋之际，九品中正制确立、门阀制度盛行、庄园经济繁荣以及天人感应神学体系崩溃，玄学思潮兴盛，道家思想得到了复兴、勃发，促进了人的觉醒、艺术的自觉，推动着艺术精神的独立，都在客观上催生了江南艺术世家的形成。值得注意的是，以琅邪王氏、陈郡谢氏为代表的江南艺术世家，不仅有着深厚的艺术修养，而且以家族为单位践行着家族式的艺术传承，这对于汉魏六朝艺术的繁荣和发展有着重要意义，也深刻影响着后世艺术的创作与传承。

大肠杆菌菌种接种到营养琼脂培养基中于37 ℃活化24 h，再接种到营养肉汤培养基中培养24 h，于3 000 r/min 下离心10 min 后弃去上清液，菌体重新悬浮于一定量的生理盐水中。基于预试验结果取100 mL接种到1 000 mL 哈密瓜汁中制成菌悬液，然后将其分装于100 mL 的无菌大试管中，每管装量50 mL[7-8]。

1.2.2 超高压二氧化碳杀菌处理

将超临界设备的处理釜预热到设定的温度，然后将装有50 mL 哈密瓜汁的试管置于处理釜中（釜提前经过75%酒精消毒），关闭放气阀，打开进气阀，经过5～10 min 的升压过程达到设定的压力，哈密瓜汁在不同的压力（10、20、35 MPa）和温度（35、45、55 ℃）分别处理10～70 min，样品处理结束后，关闭进气阀，打开放气阀，经过约15～20 min 卸压，将哈密瓜汁取出，迅速加盖冷却[9-10]。

1.2.3 超临界二氧化碳抑制哈密瓜汁中大肠杆菌的动力学分析

在无菌操作条件下，按《食品微生物检验国家标准》（GB 4789—2003），采用平板倾注计数法进行菌落计数。以无菌生理盐水或者蒸馏水适当稀释超临界CO2处理前后样品，接种于营养琼脂培养基中，于37 ℃培养24 h 后，菌落记数[11-12]。每一样品取3 个稀释度，不同稀释度接种3 个平板，选取菌落数在30～300 之间的平板进行计数。灭菌效果采用菌落存活对数lgNt/N0（Nt：处理t时间后每毫升活菌数；N0：初始菌浓度）表示。

超临界CO2对哈密瓜汁中大肠杆菌的杀菌效果，用一级反应动力学公式分析：

式中：t表示处理时间（min），D为微生物（或芽孢）的活菌数减少90%所需要的时间（min），k为在给定压力或温度值时的灭菌速率常数（min-1）。

分别取经超临界CO2处理和未经处理的大肠杆菌菌液50 mL，在离心管中以3 500 r/min 离心3～5 次（离心的转速不能太大，以保证菌体不因为离心的机械运动而受损），吸取上清液，然后将沉淀的菌体转移至0.5 mL 的微量离心管中，继续以3 000 r/min 离心20 min。最后将沉淀的菌体用3%戊二醛固定，用pH为6.8 的磷酸缓冲液反复洗涤3～5 次，再以1%锇酸固定过夜，然后用不同梯度（30%、50%、60%、70%、80%、90%）乙醇依次脱水，每次脱水15 min，再以95%乙醇脱水20 min，无水乙醇脱水两次，每次20 min，丙酮脱水两次，每次20 min，然后加入3∶1 的丙酮与环氧树脂作用2 h，再加入1∶1 的丙酮与环氧树脂作用4 h，加入纯环氧树脂渗透3 h，然后在50 ℃下以环氧树脂包埋48 h。包埋后用超薄切片机切制70 nm 切片，放入230 目的铜网中。切片以醋酸铀作用30 min 进行染色，水洗后加入柠檬酸铅作用20 min，水洗。于H-600 型透射电镜下观察。

1.2.5 数据处理

数据采用Origin 7.5 软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 超临界二氧化碳处理大肠杆菌的动力学分析

2.1.1 35 ℃下大肠杆菌存活对数与处理时间的关系

在35 ℃下采用不同压力进行处理，大肠杆菌的存活对数随着保压时间的延长而降低（图1）。不同压力下的杀菌过程均分为两个阶段，第1 阶段的灭菌速率大于第2 个阶段。在温度相同的条件下，压力从10 MPa 升至35 MPa，第1 阶段灭菌速率由0.214 6 min-1增加至 0.394 7 min-1，D值从 10.7 min 减少至 5.83 min（表1）；第2 个阶段的灭菌速率则由0.079 8 min-1增加至 0.108 min-1，D值从 28.9 min 减少至 21.32 min，压力增大大肠杆菌死亡速率也增大。在35 ℃，35 MPa超临界CO2可降低哈密瓜汁中的大肠杆菌5.74 个数量级。

2.1.2 45 ℃下大肠杆菌存活对数与处理时间的关系

在45 ℃下，压力从10 MPa 上升到35 MPa，大肠杆菌的存活数量级显著降低（图2）。10 MPa 两个杀菌阶段的R2分别为0.992 9 和0.971 1，第1 个杀菌过程的灭菌速率（0.305 8 min-1）比第2 个过程的杀菌速率（0.092 2 min-1）大的多（表 2）。20 MPa 两个杀菌阶段的R2分别为0.993 2 和0.989 5，线性拟合程度非常好。第1 个杀菌过程的死亡速率（0.360 2 min-1）也明显高于第2 个过程的死亡速率（0.132 min-1）。35 MPa压力下的灭菌规律基本相似。压力从10 MPa 升至20 MPa，第1 阶段灭菌速率由0.305 8 min-1增加至0.360 2 min-1，D值也从 7.53 min 减少至 6.39 min；第2个过程的灭菌速率则由0.0922min-1增加至0.132min-1，D值从24.97 min 减少至17.45 min。表明第1 阶段增加压力死亡速率增加缓慢，而杀菌第2 阶段压力增加时死亡速率增加较快。压力由20 MPa 上升到35 MPa，两个阶段的死亡速率分别增至0.392 4 min-1和 0.171 4 min-1，D值减少至 5.86 min 和 13.44 min。在45 ℃下，35 MPa 超临界二氧化碳处理后可降低哈密瓜汁中大肠杆菌7.22 个数量级。

表1 35 ℃下超临界CO2 对大肠杆菌的灭菌动力学方程与参数Table 1 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 35 ℃

表2 45 ℃下超临界CO2 对大肠杆菌的灭菌动力学方程与参数Table 2 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 45 ℃

2.1.3 55 ℃下大肠杆菌存活对数与处理时间的关系

由图3 可以看出，在55 ℃下，压力从10 MPa 上升到35MPa，两个杀菌阶段的大肠杆菌的存活数量级均显著降低（P＜0.05）。不同压力下第1 阶段的灭菌速率均显著大于第2 阶段，而第2 杀菌阶段的D值均大于第1 阶段（表3）。从10 MPa 增至35 MPa，第1杀菌阶段的死亡速率由0.351 9 min-1分别增至0.399 3 min-1和 0.441 7 min-1，D值由 6.54 min 依次减小到5.77 min 和5.21 min，第2 杀菌阶段的死亡速率由 0.094 9 min-1增至 0.153 6 min-1和 0.207 7 min-1，D值由24.27 min 依次减小到14.99 min 和11.09 min。

表3 55 ℃下超临界CO2 对大肠杆菌的灭菌动力学方程与参数Table 3 Inactivation kinetics equation and parameters of E.coli by SCCO2 at 55 ℃

2.2 温度和压力对超临界二氧化碳杀菌效果的影响

由图4、5 可以看出，随着温度和压力的升高大肠杆菌死亡速率也在上升。kt反应了大肠杆菌对温度的敏感程度，kt越大，大肠杆菌对超临界处理的温度越敏感。kp反应了大肠杆菌对压力的敏感程度，kp越大，大肠杆菌对超临界处理的压力越敏感。灭菌速率kt、kp与温度、压力均有良好的线性关系，说明温度、压力越高大肠杆菌敏感度越强。

2.3 超临界处理大肠杆菌的超微结构的变化

由图8 可看出，未处理的大肠杆菌外壳光滑，电镜下电子密度较均匀。超临界CO2处理大肠杆菌后，细胞内的物质被分成小块，电镜下的大肠杆菌出现大量的透电子区，细胞壁有破裂现象。这可能是因为CO2分子在高压下，进入细胞内部，扰乱了细胞的新陈代谢，破坏了一些关键酶的活性，也可能因为超临界二氧化碳作为介质渗透到细胞内部，很快达到细胞内外的压力平衡，然后突然降压导致胞内外压差急剧变化，细胞剧烈膨胀而发生破裂，从而达到破壁的效果[12]，使得细胞死亡。35 MPa 下大肠杆菌细胞有明显的胞浆泄漏现象，部分细胞壁消失。

3 结论

（1）超临界 CO2在压力 10～35 MPa、温度 35～55 ℃、时间10～70 min 的条件下处理哈密瓜汁中大肠杆菌，其灭活过程包括由快到慢两个杀菌阶段，两个阶段均符合一级反应动力学。

（2）在 35～55 ℃、10～35 MPa 条件下进行超临界二氧化碳处理，随温度和压力的提高，大肠杆菌的灭菌速率逐步上升。

（3）经过超临界CO2处理的大肠杆菌，细胞内的物质被分成小块，细胞出现缺陷，透电子区分布不均匀。35 MPa 下超临界CO2处理的大肠杆菌，有明显的胞浆泄漏现象，结构层次感完全消失，部分细胞壁消失。