矿泉水中产气荚膜梭菌检测能力验证经验

摘 要：产气荚膜梭菌（C.perfringens）又称魏氏梭菌，厌氧芽孢杆菌属。广泛存在自然界的水源、土壤及人和动物肠道中。它是条件致病菌，主要引起人的食物中毒、气性坏疽和动物猝死症等疾病。产气荚膜梭菌的重点检测项目是活菌数的测定和证实试验。GB 8538-2016饮用天然矿泉水中产气荚膜的检测标准中说明，产气荚膜梭菌在SPS平板上36 ℃下厌氧培养24 h，菌落形态为黑色。但在实际检验中SPS平板上的菌落形态难以呈黑色，如果改用TSC平板可以长出较多黑色菌落。TSC培养基中柠檬酸铁铵和亚硫酸钠的含量比SPS要高，实验证明TSC培养基要比SPS培养基更能长出黑色菌落。

关键词：矿泉水;产气荚膜梭菌;检测方法

1 矿泉水中产气荚膜梭菌能力验证遇到的问题和解决方法

2019年9月份参加矿泉水中产气荚膜梭菌能力验证中遇到的问题：滤膜无黑色菌落产生，只有少量灰色和大量白色杂菌生长。由于大量杂菌存在，导致确证试验中生化现象不明显，最终实验结果没有通过。

2019年12月份再次参加产气荚膜梭菌测量审核，综合研究GB 4789.13-2012 和GB 8538-2016及各方资料[1-2]，制定以下实验方案。

按照测量审核作业指导书，先把冻干粉水化得到的原液，然后进行10倍和100倍稀释，得到稀释液，对原液、稀释液进行检测。

方法1，取50 mL样液用0.45 μm滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS平板上，抽滤，做1个平板。

方法2，取50 mL样液用0.22 μm滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS平板上，抽滤，共2个平板。

方法3，取50 mL樣液用0.22 μm滤膜抽滤，然后将滤膜正贴在SPS平板上，再覆盖一层SPS培养基，抽滤，做1个平板。

方法4，取50 mL样液用0.22 μm膜抽滤，然后将滤膜反贴在SPS平板上，即抽滤面朝下，抽滤，做1个平板。

方法5，取50mL样液用0.22μm膜抽滤，然后将滤膜正贴在TSC平板上，抽滤，做1个平板。

同时做阴阳性对照，将以上平板在（36±1）℃下厌氧培养24 h，结果如表1所示。

验证试验，挑取各种形态不同的菌落做生化检验，验证试验结果：

所有菌落都可以在FTG旺盛生长;透明白色的菌落生化指标都不符合;灰色和黑色菌落中有部分菌的生化指标全部符合，也有部分菌的生化指标部分符合，可能是杂菌太多，挑取菌落时带有杂菌。

结果报告：参考实验中方法2的灰色菌落（136、146灰）和方法5的黑色菌落数（173黑）的数据，报了140 CFU/50 mL，通过了验证。

2 结果分析

从方法1和方法5对比看，用TSC平板贴滤膜更容易长出黑色菌落，更容易识别目标菌。这是因为TSC培养基中柠檬酸铁铵和亚硫酸钠的含量比SPS高，产气荚膜梭菌可以还原亚硫酸盐为硫醚，硫醚可以与柠檬酸铁铵反应呈黑色。增加亚硫酸盐的量和柠檬酸铁铵的量，可以增强黑色[3]。

方法5中黑色菌落在空气中暴露一段时间，颜色变浅，是因为产气荚膜梭菌能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐和铁盐的琼脂中形成黑色菌落，遇空气后被氧化，黑色渐渐变成灰色，所以培养后要尽快计数和验证。

从10倍稀释液的结果看，方法1的结果是16个灰色菌落，方法2平均为18灰色菌落，结果相差不大，因此，0.45 μm的滤膜和022 μm的滤膜都可以用。

方法3和方法4中，覆盖一层SPS培养基和滤膜反贴也能长出黑色菌落。覆盖一层长出菌落较少，反贴滤膜不利于后续挑取菌落。

SPS和TSC上都易有较多杂菌生长（TSC相对少点），且FTG是非选择性增菌肉汤。所以，杂菌较多时，可先把可疑菌分离纯化到TSC平板上，再将单菌落接到FTG中，最后进行生化试验。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部.GB 4789.13-2012 食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验[S].北京：中国标准出版社，2012.

[2]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 8538-2016 食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法[S].北京：中国标准出版社，2016.

[3]潘宝怡，吴清平，彭飞艇，等.饮用天然矿泉水中产气荚膜梭菌检测国标方法的改进[J].现代食品科技，2012（9）：1236-1238.

作者简介：徐万丽（1983—），女，广东梅州人，大专，质量工程师。研究方向：食品检测。