离心运动对2型糖尿病大鼠代谢障碍及肌纤维类型的影响

王继 杨中亚 张龙 周越

1 六盘水师范学院体育学院（贵州六盘水 553004）

2 北京体育大学运动人体科学学院（北京 100084）

许多2 型糖尿病患者在诊断过程中常发现外周神经病变相关的亚临床症状——肌萎缩[1]。骨骼肌是摄取和利用葡萄糖的重要组织，其质量和功能的降低将导致外周组织处理葡萄糖的能力降低，进一步加剧2型糖尿病的发病进程。研究发现[2-4]，在2 型糖尿病肌萎缩的发生过程中，氧化型慢肌（Ⅰ型）较酵解/氧化型快肌（Ⅱ型）的萎缩程度更明显，同时伴随骨骼肌中葡萄糖氧化酶活性的降低。而Ⅰ型肌纤维中胰岛素受体和葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT 4）表达量更高，对胰岛素和肌肉收缩等引起的葡萄糖转运作用的贡献率也更高[5]。

体育锻炼改善2 型糖尿病的原因之一是通过增加骨骼肌容量、增强骨骼肌对葡萄糖的吸收利用，从而降低血糖，进而改善糖代谢障碍[6]。研究发现，离心运动能有效刺激骨骼肌纤维增殖与肥大，并较好地恢复肌萎缩发生时的肌纤维类型构成改变，抑制肌纤维横截面积降低[7]。此外，离心运动还能更好地节省体能，提示对于心肺耐力和肌肉耐力较差的2型糖尿病患者来说，下坡跑等离心运动可能是一种更合适的锻炼方式[8]。

鉴于此，本研究通过高脂膳食联合腹腔注射链脲佐菌素（ streptozotocin，STZ）建立2 型糖尿病动物模型，观察2 型糖尿病大鼠肌纤维类型构成的变化情况，并探究4 周离心运动对2 型糖尿病大鼠糖代谢和肌纤维类型的影响及相关性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及器材

STZ 购于 Sigma 公司（S0130）；大鼠胰岛素酶联免疫（ELISA）试剂盒购于Mercodia 公司（10-1250-01）；ATP二钠盐、221（1.5M 2-amino-2-methyl-1-propanol）缓冲液购于Sigma公司（11）；甲苯胺蓝溶液购于北京索莱宝科技有限公司（G3668），其余分析纯均购于国药集团化学试剂有限公司。酶标仪购于BIO-RAD 公司，血糖仪购于强生（上海）医疗器材有限公司（稳择易®血糖仪）。

1.2 动物建模与运动

6 周龄雄性 SD 大鼠 39 只，体重 214.1 ± 7.7 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（许可证编号：SCXK/京2012-0001）。饲养、训练均于北京体育大学实验动物房内完成。分笼饲养，自由进食、饮水。湿度相对值为45%～55%，环境温度为20℃～24℃，采用12 h～12 h 循环昼夜照明，每周称重，记录大鼠体重。实验通过北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准。

以普通饲料适应性喂养5 天后随机取15 只大鼠为普通饲料组，给予普通饲料饲养9周；其余24只大鼠为高脂饲料组，给予高脂饲料饲养9 周（北京华阜康生物科技股份有限公司，H10045，能量比：脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白质20%）。高脂饲料组于9 周饲养后间隔3 天连续注射2 次STZ（单次剂量为25 mg/kg bw），普通饲料组腹腔注射相应量枸橼酸钠缓冲液。STZ 注射在30 min 内避光完成，之后恢复大鼠饮食。STZ 注射后1 周对高脂饲料组大鼠尾静脉抽血测空腹血糖浓度。参考Srinivasan 等[9]将STZ 注射后3 天空腹血糖≥11.1 mmol/L 作为成模标准，剔除不成模大鼠。1 周后复查大鼠空腹血糖浓度观察模型稳定性并剔除不成模大鼠。最终得到2 型糖尿病模型大鼠20 只，建模率为83.3%。

将普通饲料组大鼠随机分为普通对照组（C 组，n=6）和普通运动组（E 组，n=9）；将2型糖尿病模型组大鼠随机分为糖尿病对照组（D 组，n=8）和糖尿病运动组（DE组，n=12）。

普通运动组和糖尿病运动组参照Armstrong 离心运动方案[10]进行4周离心运动干预，运动期间均恢复普通饲料饲养。大鼠在正式运动训练前进行3 天适应性跑台训练：第1 天跑台坡度 0°，时间5 min；第2 天跑台坡度－5°，时间10 min；第3 天跑台坡度－5°，时间30 min；跑速均为16 m/min。休息两天后正式开始训练。运动方案：坡度－5°，跑速16 m/min，每天训练60 min，每周训练5天，共4周。

1.3 样本采集与测试

1.3.1 血样采集与测试

在4 周训练前后取所有大鼠禁食12 h 后尾血，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）水平，血糖仪测定空腹血糖浓度（fasting blood glucose，FBG）。计算大鼠胰岛素抵抗和敏感性指数。胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FINS（IU/L）×FBG（mmol/l）/22.5；胰岛素敏感性指数 ISI=1/FBG（mmol/L）×FINS（mIU/L）。

1.3.2 骨骼肌样本采集

4 周训练后，对所有大鼠称重，腹腔注射水合氯醛（浓度10%，0.4 ml/100 g bw）麻醉，腹主动脉取血；分离比目鱼肌，取肌腹位置肌肉切成0.5 cm×0.3 cm×0.3cm 左右的长块状，放入盛有OCT 包埋剂的方盒中，在液氮预冷的异戊烷中固定后包裹锡纸，存放至－80℃冰箱保存，用于制备切片。

1.3.3 ATPP--aassee异染肌纤维类型

参考王月丽、周越等[11]改良的ATP-ase染色方案区分肌纤维类型。制取冰冻切片样品，切片厚度8 μm。室温环境复温5 min 后，预孵育液中室温预孵育2 min。Tris 缓冲液洗2 min×3 次，去除残余的预孵育液。甩干，孵育液中室温孵育15 min。1% CaCl2·2H2O 水溶液中换洗 3 次，每次提拉切片 3～4 次，终止ATP-ase 反应。0.1%甲苯胺蓝水溶液中染色90 s。流水冲洗切片10～20 s，去除多余染液。依次于95%酒精、无水酒精、无水酒精中快速脱水，每次将切片上下提拉3～5 次。二甲苯透明，中性树胶封片。数码体视显微镜拍片，采用ImageJ1.43 统计不同类型肌纤维数量，Image-Pro Plus 6.0 统计不同类型肌纤维平均横截面积。

1.4 统计学分析

数据以平均数±标准差（±s）表示。采用SPSS19.0 软件进行数据统计。若数据服从正态分布，则组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时用LSD方法进行组间多重比较，方差不齐性时采用Tamhane’s方法；若数据不服从正态分布，则组间比较采用非参数检验的Mann-Whitney 检验。采用Pearson 相关分析肌纤维类型和胰岛素敏感性的相关性。以P＜0.05为显著水平，P＜0.01为非常显著水平。

2 结果

2.1 2 型糖尿病和离心运动对大鼠体重、空腹血糖和血清胰岛素的影响

与普通对照组相比，糖尿病对照组运动前的体重非常显著降低（P＜0.01），空腹血糖水平非常显著升高（P＜0.01），血清胰岛素水平非常显著降低（P＜0.01），提示9 周高脂饲养联合STZ 注射建立的2 型糖尿病大鼠模型糖代谢障碍特征明显（表1）。

4 周离心运动后，与普通对照组相比，普通运动组大鼠体重非常显著降低（P＜0.01），血清胰岛素水平非常显著降低（P＜0.01），空腹血糖有降低趋势（P=0.210）。与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组大鼠体重无显著性差异（P=0.450），空腹血糖和血清胰岛素水平均有降低趋势（P=0.170，P=0.120）（表1）。这提示4周离心运动能有效降低正常大鼠的血糖和胰岛素水平，但对糖尿病大鼠糖代谢指标无显著影响。

表1 运动前后各组大鼠体重、空腹血糖和血清胰岛素水平比较

2.2 2型糖尿病和离心运动对大鼠胰岛素敏感性的影响

与普通对照组相比，糖尿病对照组运动前的胰岛素抵抗指数非常显著升高（P＜0.01），胰岛素敏感性指数非常显著降低（P＜0.01），提示9 周高脂饲养联合STZ注射建立的2 型糖尿病大鼠模型糖代谢障碍特征明显（表2）。

4 周离心运动后，与普通对照组相比，普通运动组大鼠胰岛素抵抗指数非常显著降低（P＜0.01），胰岛素敏感性指数显著升高（P=0.030）。与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组大鼠胰岛素抵抗指数非常显著降低（P＜0.01），胰岛素敏感性指数有升高趋势（P=0.105）（表2）。这提示4 周离心运动能较好地降低正常大鼠和糖尿病大鼠胰岛素抵抗现象，提升外周组织胰岛素敏感性。

表2 运动前后各组大鼠胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感性指数比较

2.3 2型糖尿病和离心运动对大鼠肌纤维类型的影响

ATP-ase 异染结果显示，Ⅰ型肌纤维呈浅蓝色，Ⅱ型肌纤维呈深蓝色，为消除染片不同批次间色彩饱和度（纯度）的差异，统一去色（转换为灰度模式）。去色后灰色为Ⅰ型肌纤维，黑色为Ⅱ型肌纤维（图1）。

在肌纤维平均横截面积方面：与普通对照组相比，糖尿病对照组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维平均横截面积均显著减小（P＜0.01，P=0.046），其中Ⅰ型肌纤维平均横截面积减小幅度达到34.8%，Ⅱ型肌纤维为14.1%。与普通对照组相比，普通运动组大鼠Ⅰ型肌纤维平均横截面积有增大趋势（P=0.052），升高幅度达11.9%；而Ⅱ型肌纤维平均横截面积无显著变化（P=0.959）。与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维平均横截面积均显著增大（P＜0.01，P=0.045），增大幅度分别为44.7%和13.6%。

在肌纤维数量分数方面：与普通对照组相比，糖尿病对照组大鼠Ⅰ型肌纤维数量分数有降低趋势，Ⅱ型肌纤维数量分数有升高趋势（P=0.087）。与普通对照组相比，普通运动组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维数量分数均无显著变化（P=0.240）。与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组大鼠Ⅰ型肌纤维数量分数有降低趋势，Ⅱ型肌纤维数量分数有升高趋势（P=0.074）。

在肌纤维面积分数方面：与普通对照组相比，糖尿病对照组大鼠Ⅰ型肌纤维面积分数显著降低，Ⅱ型肌纤维面积分数显著升高（P＜0.01）。与普通对照组相比，普通运动组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维面积分数均无显著差异（P=0.805）；与糖尿病对照组相比，糖尿病运动组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维面积分数无显著差异（P=0.654）。

图1 比目鱼肌ATP-ase异染肌纤维类型（10×20）

2.4 Ⅰ型肌纤维类型和胰岛素敏感性的相关性分析

肌纤维面积分数综合反映了骨骼肌中不同类型肌纤维构成情况。为阐明肌纤维类型改变在运动改善2型糖尿病代谢障碍中的作用，本研究进一步分析了Ⅰ型肌纤维面积分数与胰岛素敏感性指数（ISI）的相关性（图2）。结果显示Ⅰ型肌纤维面积分数与胰岛素敏感性指数呈正相关（r=0.485，P＜0.01），提示肌纤维面积分数的改变是胰岛素敏感性改变以及运动提高胰岛素敏感性的重要原因。

表3 运动后各组大鼠肌纤维平均横截面积、数量分数和面积分数比较

图2 Ⅰ型肌纤维面积分数与胰岛素敏感性指数（ISI）散点图

3 讨论

3.1 2型糖尿病大鼠模型的建立与评价

2 型糖尿病发病常经过3 个阶段：肥胖导致胰岛素敏感性降低→胰岛B 细胞过度激活→基础胰岛素分泌增加和高胰岛素血症[12]。这种发生在2 型糖尿病早期的病理状况如果未得到有效控制，胰岛B 细胞功能将逐渐衰退，胰岛素分泌开始下降，2 型糖尿病进一步恶化，最终将发展进入2型糖尿病后期。

高脂饮食联合链脲佐菌素（STZ）注射构建符合2型糖尿病代谢特征的模型具有建模时间短、症状典型和稳定性好等特征，是最常见的糖尿病动物模型。本研究通过9 周高脂饲养联合STZ 注射建立2 型糖尿病模型，建模率达到83.3%。模型组大鼠血糖显著升高，血清胰岛素水平显著降低，胰岛素抵抗指数显著升高，胰岛素敏感性指数显著降低。这表明9 周高脂饲养联合STZ 注射建立的2 型糖尿大鼠病模型具有典型的外周组织胰岛素抵抗程度增加和胰岛素敏感性下降特征。

3.2 离心运动对2型糖尿病大鼠胰岛素敏感性的影响

通过4 周离心运动干预，正常大鼠血清胰岛素水平、胰岛素抵抗程度降低，胰岛素敏感性提高；同时也在一定程度上降低2 型糖尿病大鼠空腹血糖水平，但对其血清胰岛素水平无明显影响，最终降低胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性。离心运动能显著改善2 型糖尿病大鼠的糖代谢障碍和胰岛素敏感性，这可能与离心运动提高2 型糖尿病大鼠骨骼肌容量和功能有关。研究[13]发现，随着年龄增长与肥胖的发展，糖、脂代谢障碍使骨骼肌质量和功能出现进行性下降。骨骼肌是负责外周葡萄糖摄取和利用的重要组织，其质量和功能的降低将直接导致骨骼肌容量降低，胰岛素敏感性下降。

不习惯的离心收缩会诱导损伤进而降低骨骼中GLUT4 的水平，这是导致一过性胰岛素抵抗的重要原因[14]；但规律的离心运动能带来更大的运动后肌肉肥大效应[15]，同样也能对葡萄糖耐量产生积极作用[16]。研究发现，规律的离心运动能有效降低糖尿病前期患者的低密度脂蛋白和胰岛素抵抗水平[17]，提示离心运动在有效刺激骨骼肌纤维增殖与肥大，提升骨骼肌功能和改善胰岛素敏感性方面有广泛的应用前景[7]。

研究还发现[8]，与下坡跑相比，3周中等强度上坡跑能更有效降低2 型糖尿病患者的甘油三酯、空腹血糖，升高血清胰岛素并改善葡萄糖耐量。但是在调整能量消耗后发现，上坡跑和下坡跑所有的代谢参数差异消失。这表明在能量消耗相同的前提下，规律的向心耐力运动（上坡跑）和离心耐力运动（下坡跑）能达到相同的效果，提示上坡跑是一种更为高效的锻炼方式。但是，对于有氧能力和肌肉耐力较差的2 型糖尿病患者来说，下坡跑能更好地节省体能，可能是更合适的锻炼方式。

3.3 2 型糖尿病大鼠肌纤维类型改变及离心运动干预效果分析

根据肌纤维的ATP-ase 活性可以将肌纤维分为Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维。其中Ⅰ型肌纤维ATP-ase 活力较低，但由于毛细血管密度、肌红蛋白和糖转运蛋白含量以及有氧代谢酶活性都较强，其持续氧化供能的能力也较强，因此又称为氧化型纤维；Ⅱ型肌纤维ATP-ase 活力较高，根据ATP-ase 活力由高到低又可以分为ⅡB 型、ⅡX 型和ⅡA 型，与Ⅰ型肌纤维不同的是其有氧代谢能力较差，但通过糖酵解和磷酸原系统短时间大量供能能力强[18]。

Gaster等[2]的研究表明，与健康受试者相比，肥胖受试者慢肌纤维比例降低至86%，而2型糖尿病患者慢肌比例降低至75%。本研究显示，糖尿病对照组大鼠比目鱼肌Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维平均横截面积较普通对照组均显著降低，其中Ⅰ型肌纤维平均横截面积降低幅度达到34.8%，Ⅱ型肌纤维平均横截面积降低幅度为14.1%。伴随Ⅰ型肌纤维数量分数的降低和Ⅱ型肌纤维数量分数的提高，最终糖尿病对照组大鼠Ⅰ型肌纤维面积分数显著降低，Ⅱ型肌纤维面积分数显著提高。由于慢肌对葡萄糖的利用率更高，慢肌比例下降也将进一步加剧肥胖及2 型糖尿病的代谢障碍[5]。此外，研究[3]还发现，在2 型糖尿病患者中，慢肌纤维面积分数降低的同时还伴随骨骼肌中琥珀酸脱氢酶（succi⁃nate dehydrogenase，SDH）活性的降低，氧化酶活性的降低将直接导致三羧酸循环受阻，加剧骨骼肌糖脂代谢障碍[19]。

4周离心运动后，糖尿病运动组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维平均横截面积均显著升高，升高幅度分别为44.7%和13.6%。离心运动导致2 型糖尿病大鼠比目鱼肌Ⅰ型肌纤维横截面积增加幅度更大，可能与比目鱼肌中慢肌在低强度离心运动中选择性募集和损伤再生有关。但伴随肌纤维数量分数的反向变化，普通运动组和糖尿病运动组大鼠Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维面积分数与对照组相比均无显著差异。

Ⅰ型肌纤维的己糖激酶Ⅱ、糖原合成酶（GS）和丙酮酸脱氢酶-E1α（PDH-E1α）等糖代谢关键酶活性均较Ⅱ型肌纤维更高，葡萄糖代谢能力更强；此外，Ⅰ型肌纤维中胰岛素受体和GLUT 4表达量也更高，CLUT4作为骨骼肌细胞转运葡萄糖的重要载体，主要对胰岛素和肌肉收缩等刺激因素引起的葡萄糖转运起作用[5]。离体实验表明，胰岛素刺激的葡萄糖摄取率与Ⅰ型纤维的比例呈正相关[20]。

本研究显示，Ⅰ型肌纤维面积分数与胰岛素敏感性指数呈中度正相关。在肥胖和2 型糖尿病患者中，慢肌中的GLUT4 密度比快肌更低[2]。慢肌比例的降低联合慢肌中GLUT4 含量的降低，导致与胰岛素相关的GLUT4 总含量降低，是2 型糖尿病患者骨骼肌胰岛素抵抗增加，敏感性下降和葡萄糖代谢障碍的重要原因；而离心运动通过提高骨骼肌容量，改善肌纤维构成失衡，进而降低2 型糖尿病胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，最终改善2型糖尿病代谢障碍。

4 总结

9周高脂饲养联合STZ注射成功构建符合2型糖尿病代谢特征的大鼠模型。2 型糖尿病大鼠骨骼肌容量降低，尤其是葡萄糖代谢能力强的Ⅰ型肌纤维容量降低，是导致2 型糖尿病糖代谢障碍的重要原因；而4 周离心运动能在一定程度上恢复失衡的肌纤维构成，这可能是离心运动降低2 型糖尿病胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性的重要原因。