HPLC-DAD法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的方法

伍涛，肖裕章，李成洪，邓余，唐达，陈诚，唐红梅

(1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.重庆方通动物药业有限公司，重庆 402460)

益母草(Leonurusjaponicus)又名茺蔚[1]，近年来在畜牧业中的应用越来越广泛[2-3]，其有效活性成分主要是盐酸益母草碱和盐酸水苏碱[4-5].盐酸益母草碱主要用于妇科和心血管系统疾病治疗[6]，而盐酸水苏碱具有抗氧化、延缓心力衰竭、利尿消肿、收缩子宫、抗炎等功效，在兽医临床上常用于辅助母猪产后消炎[7-9].因此，将盐酸水苏碱作为益母草颗粒的检测指标具有一定科学依据[10-11].

目前，益母草颗粒中盐酸水苏碱含量测定主要有薄层色谱扫描法[12]、紫外分光光度法[13]、高效液相色谱法[14-16]、HPCE法[17]和TLCS法[18]，以及延伸的LC-MS法和LC-QDA法[19-20].薄层扫描法耗时、过程繁琐且结果较粗略，其他方法仪器检测成本和维护费用高，操作较复杂，不利于推广应用.高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法具有操作简单、易于普及和加样回收率高的特点[21]，与普通紫外检测器比较，具有更高的准确性，且全波段扫描的结果更为直观，所得色谱分离度好，重复性高，精密度好，可以用作益母草颗粒质量评价中盐酸水苏碱含量的测定，同时也为该类中药制剂检测提供了新的思路.

1 材料与方法

1.1 试验材料

盐酸水苏碱对照品(批号：110712-201614，含量100%)购自中国食品药品检定研究院；益母草药材和益母草颗粒购自中国(荣昌)畜牧产品交易市场；乙腈，色谱级，购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司；磷酸、乙醇和乙腈，分析纯，购于重庆川东化工(集团)有限公司.

安捷伦1260高效液相色谱仪：四元泵VL：G7129A；DAD检测器：G7115A；自动进样器：G7111A；LC1260色谱工作站；SB-5200DTD 超声波清洗机购于宁波新芝生物科技股份有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 对照品储备液的制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加入70%乙醇溶液使其溶解，制成每1 mL含1 mg的溶液.

1.2.2 对照品溶液的制备精密称取盐酸水苏碱对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液.

1.2.3 供试品溶液的制备取研细后的益母草颗粒0.5 g(或益母草药材粉末约0.3 g)，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入适量的70%乙醇，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)20 min，冷却，用70%乙醇定溶25 mL，摇匀，过滤，取续滤液.

1.2.4 阴性供试品溶液的制备按益母草颗粒剂处方工艺制备取缺益母草的阴性颗粒剂作为阴性供试品，同供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液.

1.2.5 检出限、定量限对照品溶液的制备精密量取盐酸水苏碱对照储备液2 mL置100 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，再从中精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀.

1.2.6 标准工作溶液的制备精密量取盐酸水苏碱对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、6.0、10.0 mL分别置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀释，定容，即得盐酸水苏碱质量浓度分别为0.049 88、0.099 75、0.199 5、0.299 3、0.598 5、0.997 5 mg/mL的溶液.

1.2.7 专属性试验取对照品、供试品和阴性供试品溶液进行测定，记录色谱图.

1.2.8 检出限、定量限取检测限、定量限对照品溶液进行测定，按3倍信噪比(S/N>3)为检测限、10倍信噪比(S/N>10)为定量限计算.

1.2.9 线性范围考察取标准工作溶液进行测定，记录峰面积，以盐酸水苏碱峰面积(Y)为纵坐标，对照品进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，并对盐酸水苏碱对照品进样量和峰面积进行回归统计.

1.2.10 精密度试验取对照品溶液进行测定，精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录盐酸水苏碱的峰面积.

1.2.11 重复性试验取对照品溶液，并同时制备6份供试品溶液进行测定，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，测定盐酸水苏碱的峰面积.

1.2.12 供试品稳定性试验取益母草颗粒(批号：170901)样品制备成供试品溶液进行测定，分别于0、2、6、8、10、13 h共计6个时间点进样测定盐酸水苏碱的峰面积并统计结果.

1.2.13 加样回收试验精密取9份已知含量的益母草颗粒样品(批号：170901，含量5.11 mg/g)约0.5 g，分别置50 mL量瓶中，第1、2、3份精密加入对照品贮备液(1.102 1 mg/mL)8 mL，第4、5、6份精密加入10 mL，第7、8、9份精密加入12 mL，精密加入70%乙醇近刻度，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)20 min，冷却，再加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.以1.2.8项的色谱条件进行测定，精密吸取对照品溶液(0.984 4 mg/mL)和供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪中，测定盐酸水苏碱的峰面积，并计算含量.

2 结果与分析

2.1 试验条件的选择

2.1.1 样品处理方法的选择参照2015版的《中国兽药典》[1]和《中国药典》[10]中益母草及益母草颗粒中盐酸水苏碱含量项下的样品处理方法，分别对回流和超声处理样品进行对比考察，发现超声处理与回流2 h的结果无差别，但相比之下超声处理更加简便，且耗时短，效率更高.因此，本研究选择超声处理法处理样品.

2.1.2 流动相的选择以乙腈和水作为流动相，筛选出最佳比例流动相.通过对乙腈∶水分别为80∶20、78∶22、75∶25、85∶15和90∶10不同比例分别进行考察，发现乙腈∶水为85∶15分离较差，乙腈∶水为90∶10保留时间长、峰形较差，乙腈∶水为80∶20、78∶22、75∶25均可达到较好的效果.综合考虑，本研究选择流动相为乙腈∶水(80∶20).

2.1.3 色谱柱和色谱条件的选择为确定色谱柱对盐酸水苏碱的分离效果，分别对Welch XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Waters NH2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Waters X Bridge HILIC色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)3种不同色谱柱进行考察，发现C18色谱柱保留时间过长且峰形较差，氨基色谱柱和 HILIC色谱柱都能达到较好的分离，但HILIC色谱柱峰形更好，因此本研究选择HILIC色谱柱进行试验.色谱条件为：Waters X Bridge HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈∶水(80∶20)；流速为1 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL.

2.1.4 试验温度的选择为研究温度对盐酸水苏碱含量测定的影响，分别选择25、30、35、40 ℃进行考察，发现温度越高保留时间越短，分离度增大.综合考虑，本研究选择30 ℃为试验温度.

2.2 专属性试验结果

试验结果显示，样品色谱图中出现的色谱峰和对照品主峰的保留时间一致，而阴性对照在此保留时间无色谱峰(图1)，这表明益母草的阴性样品无干扰.

2.3 检出限、定量限试验结果

通过计算，检出限结果为0.015 96 μg/mL，定量限结果为0.045 88 μg/mL.

2.4 线性范围考察结果

回归方程为：Y=2 646 403.256 7x+368.115 1，相关系数r=0.999 97.结果表明，盐酸水苏碱含量在0.05～1.00 μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系(图2).

图2 盐酸水苏碱线性回归图Figure 2 Linear regression of stachydrine hydrochloride

2.5 精密度试验结果

连续进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.52%(表1)，表明本方法的精密度良好.

表1 精密度试验

A：盐酸水苏碱对照品；B：益母草药材；C：益母草颗粒；D：益母草颗粒阴性样品；E：空白试剂.A：Stachysite hydrochloride reference；B：Leonurus herb medicinal material；C：Leonurus granule；D：Leonurus granule negative sample；E：Blank reagent.图1 专属性试验色谱图Figure 1 Chromatogram of specificity test

2.6 重复性试验结果

测得6份供试品溶液中盐酸水苏碱平均含量为5.11 mg/g，RSD为0.64%(表2)，表明本方法的重复性良好.

2.7 供试品溶液稳定性试验结果

供试品溶液稳定性试验结果为RSD为0.71%(表3)，表明供试品溶液在13 h内稳定.

2.8 加样回收试验结果

对9份已知含量的益母草颗粒样品的平均回收率为109.89%，RSD1.03%(表4)，表明本方法回收率较高.

表2 重复性试验的测定

表3 稳定性试验的测定

表4 回收率的测定

3 讨论

3.1 盐酸水苏碱结构

盐酸水苏碱分子量小，不仅含有碱性基团NH4+，还含有酸性基团COOH-，具有很强的极性，在水中极易溶解，在常规的C18柱上难以有效保留[22].因此，采用常规的生物碱分析方法难以有效分离盐酸水苏碱.

3.2 测定条件

3.3 同类研究

近年来，许多研究者对益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的测定方法进行了探索，主要有紫外分光光度法、高效液相色谱法和TLCS法，延伸的方法有LC-MS法和LC-QDA法.但这些检测方法均具有明显的局限性，如仪器成本高，维护费用高，操作较复杂等，难以在生产实践中进行推广应用.因此选择1种快速、方便、精确的盐酸水苏碱含量测定方法是建立益母草颗粒质量评价标准的现实需要.

3.4 国标对比

在中国药典2015版一部中，益母草含量项下测定盐酸水苏碱所使用的是蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法，益母草颗粒含量项下使用的是薄层色谱扫描法[10].而在兽药生产实践中，此类方法处理复杂耗时，薄层色谱法测定含量误差较大.而本研究使用的HPLC-DAD法操作简单，易于普及推广使用，同时与普通紫外检测器比较，更具准确性，可全波段扫描，结果更直观.此外，该方法所得色谱分离度好、重复性高、精密度好，可用于相关产品的质量控制，也为该中药其他单位制剂检测提供了新思路和新方法.

4 结论

本研究采用HPLC-DAD法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱的含量，离度好、重复性高、精密度好，盐酸水苏碱可以得到更好的保留，且各项检测指标均能达到要求，同时操作简单，利于推广应用，为益母草颗粒及其他单位制剂提供参考及借鉴，具有良好的开发前景.