烟草—玉米轮作对烟草病毒病的影响

杨洋 杨懿德 贺小蓉

摘要：以宜宾烟区为对象，以其主要的烟草与玉米轮作种植模式为切入点，分析种植模式对病毒及烟株发病的影响。结果表明，连续植烟的田块尤其是连续植烟8年的田块，病毒病发生较重。通过烟田土壤病毒检测，明确连续植烟能够增加土壤中病毒的积累量;土壤中烟根残体是病毒重要的侵染源之一。烟草—玉米轮作种植模式能够明显减弱病毒病发生。表明同一生长环境中，在周边毒源植物、传播介体和管理模式差异不大的条件下，烟草的种植模式对病毒病的发病程度有较为明显的影响。

关键词：烟草;玉米;连作;轮作;病毒病

烟草在生长过程中易受各类病原侵染，尤其是各种植物病毒。据报道，目前世界上能够侵染烟草的病毒有40多种，我国有20余种[1-2]。近年来，由于气候、耕作制度、种植品种变化及烟叶产区调整，个别地区烟草病毒病的发生呈上升趋势，病害发生时间提前，对烟叶产量和质量造成较大威胁。

病毒的传播方式是病毒病流行的特征，是重要决定因素。烟株在田间发生病毒病的主要原因包括苗期带毒、昆虫传毒、土壤带毒传毒等。在规范的育苗条件下，漂浮育苗期不是病毒传播的主要途径[3-4]。而海拔较高的植烟区，移栽前期气候冷凉，蚜虫数量及迁飞少，蚜虫传毒也非主要传播途径。因此，土壤传毒则成为部分烟区烟草病毒传播的主要途径。据报道，一些土壤颗粒有吸附病毒粒子的能力，并且增强病毒粒子在土壤中的稳定性[5]。这些病毒粒子极易通过根系的伤口侵入烟株，田间移苗时，土壤中的各种昆虫会使根系产生许多微伤口，土壤病残体中的病毒便会趁机侵入烟苗根部。

因此，在同一生长条件，苗期带毒、昆虫传毒和烟田管理影响差异不大的情况下，推测相邻田块病毒病发病存在的差异与土壤中病毒的积累水平有关。轮作、间作套种等种植模式可直接影响土壤结构、营养、微生物丰度及生态环境，同时影响病原物在土壤中的积累量[6]。宜宾烟草种植有比较久远的历史，本研究以宜宾烟区为对象，以玉米和烟草轮作为主要的种植模式，对比烟草连作，分析对病毒病发生的影响，进而为当地病毒病综合控制提供参考依据。

1 试验方法

1.1 烟草病毒病发病调查

调查地点：宜宾市兴文县、筠连县、珙县、屏山县各烟区。

调查时间：2019年4—6月，对宜宾烟草病毒病进行调查。

调查方法：5点取样法，每点固定30株，共150株，统计发病率及病情指数。

烟草病毒病分级依照行业标准YC/T 39—1996中病毒病分级标准调查：0级：全株无病;1级：心叶脉明或轻微花叶，或上部1/3叶片花叶但不变形，植株无明显矮化;2级：1/3至1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3以上;3级：1/2至2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2至2/3;4级：全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3至1/2。

发病率=发病株数/调查总株数×100%;

病情指数=∑（各级发病数×各级代表值）/（调查总株数×最高级别代表值）×100;

相对防效=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.2 土壤取样

2019年的4—6月，于宜宾市兴文县、筠连县、珙县、屏山县各烟区，在不同种植模式下的烟田取样。分别取3株烟草根系周围的土壤，混合为1个土样，取样信息见表1。

1.3 病毒鉴定

1.3.1 植株总RNA提取 2019年6—10月，在四川农业大学病理实验室将采集到的病株材料适量研磨至粉末，分别迅速加入400 μL RNA缓冲液（20 mmol/L Tris·HCl（pH值8.0），1% SDS，200 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA）和400 μL混合液（水饱和酚 ∶ 三氯甲烷 ∶ 异戊醇=25 ∶ 24 ∶ 1）充分混匀。4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清至另一离心管中。加入2倍体积的4 mol/L LiCl，混匀，-20 ℃沉淀20 min以上。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清。1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，离心 3 min，室温放置10 min使乙醇完全挥发。所得沉淀溶解于30 μL的无菌ddH2O中，吸取2 μL电泳检测，剩余RNA保存于-70 ℃备用。

1.3.2 土壤病毒RNA提取 取土壤于50 mL離心管中，加入0.02 mol/L PBS（浸没土壤即可），150 r/min 室温振荡混匀4～6 h;再于 4 000 r/min 离心10 min，将上清液转移至RNase-free和 DNase-free 管中;加入PEG-6000且使其浓度达到20%，室温放置35～45 min;取上步所得溶液 600 μL 到2 mL RNase-free和DNase-free管中并加入2倍体积的4 mol/L LiCl，-20 ℃以下沉淀2 h以上;12 000 r/min离心15 min，弃上清液，向管中加入1 mL 70%乙醇溶液，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，12 000 r/min离心1 min，室温干燥（尽量去除干净乙醇，防止影响下游反应）。

1.3.3 RT-PCR扩增 反转录：在0.2 mL离心管中加入RNA模板8 μL、下游引物2 μL，混匀后，72 ℃ 水浴变性5 min，迅速置于冰上5 min，再依次加入RNase Inhibitor 0.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、5×first buffer 5 μL、M-MLV反向转录酶 0.5 μL;总体积20 μL，42 ℃水浴，60 min 后取出置于-20 ℃备用。

PCR反应体系为：ddH2O 13.3 μL;10×ex Taq Buffer 2.5 μL;正向引物1 μL;反向引物1 μL;dNTP（2.5 mmol/L）2 μL;第一链cDNA合成产物5 μL;ex Taq酶0.1 μL;总体积为25 μL，混匀后稍离心。所用引物序列见表2。

PCR反应条件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，循环34次;72 ℃ 10 min。

2 结果与分析

2.1 烟草连作、烟草与玉米轮作种植模式下烟草病毒病的发病调查

对宜宾各烟区的病毒病进行调查，兴文县各村的病情指数在4～20，珙县各村的病情指数在2～11，筠连县各村的病情指数在3～5，屏山县各村的病情指数大多在5～19（图1）。兴文县病毒病发病相对较高，筠连县发病较轻，各村的病情指数存在差异，亦存在局部发病较重的田块，这些田块主要分布在海拔1 000 m以上的长期植烟区。

进一步对这些植烟区进行调查，种植模式是主

要的差异。兴文县仙峰苗族乡同一种植点的烟田调查显示，连续植烟8年的田块部分烟株因病毒病过于严重已经拔除，后续补苗发病率近100%，病情指数达53.50;连续植烟2年的田块病情指数在22以上，发病情况较严重;邻近玉米和烟草轮作田块病情指数较低，病情指数约为12。大雪村一烟田近3年连续植烟，病情指数达30.50，邻近玉米和烟草轮作1年的田块，病情指数为15.50。杜家垇村近3年连续植烟的一田块发病率极高，病情指数达到42;邻近玉米和烟草轮作1年的田块，病情指数为13，具体数据见表3、图2。说明在同一生长环境下，排除周边毒源植物、传播介体和管理模式的影响，烟草连作与玉米轮作的不同种植模式对烟草发病程度具有较大影响，连续植烟病毒病的发生程度有明显加重现象。

2.2 烟草连作、烟草与玉米轮作种植模式下土壤携带病毒检测及活力分析

前期对宜宾烟草发病烟株病毒种类进行的检测表明TMV的检出率最高，几乎达到100%，其次为CMV、TVBMV、PVY。鉴于TMV抗逆性极强，后续土壤分析则针对TMV进行。

取田间烟草连作、烟草与玉米轮作种植模式下不同发病程度的烟株根际土壤，对TMV进行半定量PCR检测，结果如图3所示。除了土壤样品1、2发病重，其病毒检测水平不高之外，其他发病重的烟株根际周围土壤的TMV病毒含量比发病轻的TMV病毒含量多，说明烟株的发病程度和土壤中TMV病毒的丰度有关，进而表明土壤中TMV的积累水平受烟草连作及轮作的影响。

为了验证这些土壤中存在的病毒粒子是否具有活性，将前作为玉米的烟田、烟草连作2年、8年的土壤浸泡缓冲液，接种于心叶烟，通过形成的枯斑数量判断TMV是否具有活性。接种后4 d，前茬为玉米的烟田和连作2年的烟田土样，心叶烟上形成了几个枯斑;连作8年的土样形成的枯斑数量较多，达10个以上（图4）。由此可见，土壤中的病毒粒子在长期连作下，积累数量增多，且TMV具有活力。

2.3 田间残留烟根病毒种类和活力检测

烟草病毒的初侵染源除了土壤，还有土壤中的病残体。2019年4月在兴文县群鱼村调查前茬为烟草的田块，在烟苗移栽前，取土壤中残留的烟根进行病毒种类检测和活性分析。根据前期病毒种类的检测，对TVBMV、TMV、CMV、PVY进行检测，结果表明15个烟根中均含有烟草脉带花叶病毒TVBMV，10个具有TMV，8个含CMV，未检测到PVY（图5）。将检测有病毒的烟根残体1、4、5、6研磨成汁液，接种于心叶烟幼苗，接种后第5天在接种叶出现明显的枯斑（图6）。在云烟上接种，第20天出现明显的花叶和畸形（图7），表明烟田土壤中残留烟根携带的病毒也可作为第2年烟草病毒的侵染源。

3 讨论

我国烟叶产区跨度大，气候、耕作制度和农业生态条件均有较大差异，烟草病毒种类复杂，各烟区间病毒的种群动态和分布差异明显。

2018—2019年对宜宾烟区烟草病毒病进行了全面调查，烟草—玉米轮作是宜宾烟区的主要种植模式，在该种植模式下烟草病毒病发病总体不高，对烟叶产量没有明显影响。然而亦存在烟草连作多年的田块，尤其是5年以上的连作田块病毒病发病较重。有报道表明，连作烟田土壤中病毒含量明显比水旱轮作田块中高，说明轮作对减轻烟草病毒病有显著效果，这也可能是因为轮作对病地土壤中的病毒有降解作用[7-8]。轮作对黄瓜绿斑驳花叶病毒发病地土壤中的病毒有降解作用[9]。

本研究通过半定量RT-PCR，也表明烟草连作多年田块的土壤中的病毒量比烟草—玉米轮作田块土壤高。连年种植烟草给病毒提供了可以增殖的时间和空间，由于TMV抗逆性较强，加上植烟年限持续升高，烟田土壤中TMV不断积累，成为当地烟草病毒病发生的重要因素之一[10-11]。

此外，对前茬为烟草的烟田残留根系进行检测，其病毒检出率较高，且具有活性。有报道指出，如果土壤中的烟根、茎秆等病残体碎屑清理不及时或不清理，散布在土壤中的烟草病毒极易通过根损伤、根部的线虫以及地下害虫危害等途径将病毒传入烟草。因此，这些残留的烟根以及散落在土壤中的病毒，是烟草移栽后的重要初始病毒侵染源。随着烟株根系伸长时穿过砂粒受伤，病毒可接触到伤口侵染;或随着根毛相互扭结，病毒随分泌物进入健康根也可能造成传染。

由于烟草病毒病不仅具有机械传播性、虫传性，还有土传性，能够切断传播途径的措施都将是行之有效的控病措施。国内利用麦烟套作、烟和油菜套种的时间差来防治烟草病毒病具有良好效果。本研究通过烟草和玉米轮作种植模式下的病害调查，表明这种种植模式对烟草病毒病也具有较好的防治效果，可为其他地区的烟草种植提供参考依據。

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