高粱黑粉菌黑色素的理化性质和与Cu2+和Fe3+的络合作用

鲁 明，史 琳，于 淼，付 欣

（1.辽宁省农业科学院 食品与加工研究所，沈阳110161;2.沈阳农业大学 食品学院,沈阳110161）

高粱黑粉菌作为担子菌纲真菌，属于食用菌类。在中国，它被广泛应用于民间常用中药，具有很多功效，如调节月经、止血、降低血液胆固醇、控制体重、预防结肠炎和冠心病等[1]。高粱黑粉菌成熟后白膜破裂黑粉散出，及时采摘、晒干、粉碎得到黑粉，以此为原料提取得到的黑色素为高粱黑粉菌黑色素。高粱黑粉菌黑色素是真黑色素类，真黑色素广泛存在于自然界生物体内，如香蕉皮、花椒籽、山杏种皮等植物中；短梗霉、链霉菌、粒毛盘菌等微生物中以及乌骨鸡、鱿鱼墨、林蛙卵等动物中[2]。不同黑色素都有一定特异性，天然黑色素资源开发是当前研究一大热。天然黑色素不仅可以作为天然色素应用于食品行业，也广泛应用于其他领域，如在化妆品行业可应用于制备染发膏、防晒霜等；农业上可应用于生物杀虫剂；医药上可应用于抗病毒、抗真菌药物等[3-4]。高粱黑粉菌不仅黑色素含量高，而且营养非常丰富，近年来越来越受到国内外学者的关注[5-6]。天然黑色素是大分子聚合物，不溶于水及有机溶剂，因其具有很强的鳌合能力，往往可以富集很多微量元素，如能够增加人体细胞免疫的Cu、Fe、Zn、Mn、Co和Ni等[7]。有研究表明，通过黑色素的鳌合作用还可以抑制诱导剂引发的一些基因突变[8]。

本试验对高粱黑粉菌中提取的黑色素的理化性质进行研究，并应用红外光谱仪考察不同pH值条件下高粱黑粉菌黑色素同Cu2+和Fe3+的相互作用情况，深入了解高粱黑粉菌黑色素的稳定性、鳌合金属离子能力，以期为其作为功能食品的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

材料：高粱黑粉菌菌粉，采集于辽宁省农业科学院国家高粱改良中心基地。7月中旬采收，去除苞叶，在通风良好的室内阴干，粉碎保存。

主要试剂：无水乙醇（分析纯）、硫酸铜、氯化铁、氯化镁、氯化钙、氯化铝、硫酸锌、硫酸锰、HCl（分析纯）、氨水（分析纯）、NaOH（分析纯）、95%乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、DMSO、苯甲酸钠、维生素 C以上均购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）购自美国Sigma公司。

主要仪器设备：VARi0 ELⅢ型CHNS/O元素分析仪（美国PerkinElmer公司）；UV-1600型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；Evolution 201型紫外可见分光光度计（美国ThermoFisher公司）；电热恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）；SHZ-IIIB型循环水真空泵（河南巩义科学仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏仪器设备有限公司）；SB25-12DTN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；Milli-Q integral型超纯水机（德国Merck公司）；pHS-25型酸度计（上海理达仪器厂）；Bruker-IFS-55红外光谱仪（德国Bruker公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Centrifuge 5804R型离心机（德国Eppendorf公司）；微波炉（中国格兰仕公司）。

1.2 方法

1.2.1 黑色素的提取 取高粱黑粉菌菌粉5g，HCl水解，浓度3mol·L-1，料液比1∶20(W/V)，60℃水浴水解 4h，调NaOH浸提液pH值13，超声功率240W、超声温度50℃、提取时间2h。调pH值2.0～3.0，静置4h后，以3000r·min-1离心10min，用去离子水反复洗涤沉淀至中性，烘干，得到黑褐色粉末，即高粱黑粉菌黑色素粗品。

1.2.2 黑色素的纯化及溶液配制 将高粱黑粉菌黑色素粗品0.5g，溶于1mol·L-1NaOH水溶液中，以3000·min-1离心10min，所得上清液，再使用6mol·L-1HCl调pH值2.0～3.0，再把所得的沉淀采用3000r·min-1离心10min，之后用去离子水洗涤至中性，烘干至恒重备用。

取0.1g纯化干燥后的黑色素，参照SAVA等[9]方法，加入100mL氨水，利用超声辅助溶解，用旋转蒸发仪减压抽除多余NH3，直至pH值7.5，并用去离子水定容至100mL。

1.2.3 溶解性 精确称取纯化黑色素0.1g，在室温下分别加入100mL蒸馏水、10%稀硫酸、氨水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、DMSO、丙酮和石油醚溶液，充分混合均匀考察其溶解性。根据不同的溶解情况来判断其溶解性质。

1.2.4 pH值对色素稳定性的影响 用NaOH或HCl将黑色素溶液调至不同pH值（3.0，5.0，7.0，9.16，10.83），观察溶液颜色变化并于215nm处测定吸光值A。

1.2.5 温度对黑色素稳定性的影响 取20mL黑粉菌黑色素的溶液分成5份，分别置于不同温度（40，60，80，100℃）下的恒温水浴中保温，每隔30min取样1次，自来水冷却后，在215nm处测定吸光值A，观察温度对色素的影响。

1.2.6 光照对黑色素稳定性的影响 将黑粉菌黑色素溶液分成两份，第1份放置于自然光下经过4d，每间隔1d取样测定；第2份在紫外灯下处理30和60min后取样测定。215nm处测定吸光值A。

1.2.7 微波对黑色素稳定性的影响 取50mL高粱黑粉菌黑色素的溶液倒入100mL锥形瓶中，置于微波炉中，设置800W固定功率下下分别加热不同时间（0，5，10，15，20，25，30min），待冷却后，于215nm处测定其吸光值A。

1.2.8 氧化剂对黑色素稳定性的影响 取25mL高粱黑粉菌黑色素的溶液分成5份，氧化剂选用30%的H2O2，分别向其加入0，2，4，6，8，10mL然后用水定容至50mL，摇匀后室温放置2h，215nm处测定吸光值A。

1.2.9 还原剂对黑色素稳定性的影响 取25mL高粱黑粉菌黑色素的溶液分成5份，采用Na2SO3作为还原剂，配置不同浓度 （0，0.2，0.4，0.8，1g·mL-1）的Na2SO3色素水溶液，摇匀后室温静置2h，每隔一定时间取样，在215nm处测定吸光值A。

1.2.10 不同金属离子对黑色素稳定性的影响 分别配制1mL 0.01mmol·L-1金属离子溶液，包括Cu2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、A13+、Fe3+离子，取7份10mL高粱黑粉菌黑色素溶液分别与离子溶液混合，每隔60min分别在215nm处测定其吸光值A。

1.2.11 Vc对黑色素稳定性的影响 取高粱黑粉菌黑色素溶液10mL，分别加入1mL不同浓度（0，0.2，0.4，0.8，1g·mL-1）的 Vc，混匀后避光放置 1h，然后测定其在 215nm 处的吸光值 A。

1.2.12 苯甲酸钠对黑色素稳定性的影响 取高粱黑粉菌黑色素溶液10mL，分别加入1mL不同浓度（0，0.001，0.002，0.003，0.004mol·L-1）的苯甲酸钠，混匀后避光放置 1h，然后测定其在 215nm 处的吸光值 A。

1.2.13 黑粉菌黑色素的紫外光谱检测 取高粱黑粉菌黑色素溶液20mL，在UV-1600型紫外可见分光光度计上，在200～400nm区间范围内测其紫外吸收光谱，进行分析。

1.2.14 黑粉菌黑色素与Cu2+和Fe3+络合物的红外光谱检测 络合物试验：按照文献中的方法[8-9]，称取高粱黑粉菌黑色素样品25mg，溶于lmol·L-1的NaOH溶液中制成水溶液100mL，然后用0.45μm微孔滤膜抽滤，待用。将本溶液分成两等份，分别向其中加入0.02mol·L-1CuSO4溶液25mL和0.02mol·L-1FeCl3溶液25mL，静置12h。用1mol·L-1HCl或1mol·L-1NaOH调节pH值分别为2.0，3.0，4.0和4.5，继续静置12h。酸化溶液后蒸煮，5000 mol·L-1离心10min，得沉淀，真空烘干以待测定。

红外检测：采用溴化钾压片法，将事先充分干燥的分析纯溴化钾粉末100～200mg与1～2mg干燥的黑粉菌黑色素样品混合，用研钵在干净环境中研磨5～10min，研细混匀后转移到模具中，放好压杆，将样品压成透明薄片。在Bruker-IFS-55红外光谱仪上，在400～4000cm-1区间范围内测其红外吸收光谱，进行分析。

2 结果与分析

2.1 黑粉菌黑色素的理化性质

由图1可知，高粱黑粉菌黑色素在显微镜下大多呈棕色、棕黑色的无定形、不规则片状。

2.1.1 黑粉菌黑色素的溶解性 由表1可知，高粱黑粉菌黑色素难溶于水、酸、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈和丙酮等大多数有机溶剂，却易溶于偏碱性的极性溶液，微溶于二甲基亚砜、甲醇，并且在强酸性溶液中可以沉淀析出。因此，可以利用碱提酸沉法提取高粱黑粉菌黑色素。

2.1.2 pH值对黑色素稳定性的影响 由表2可知，高粱黑粉菌黑色素在pH值3.0～5.0的范围内呈现浅棕色，当pH值大于8.0时，黑色素的颜色变为深棕色，说明高粱黑粉菌黑色素在碱性条件下溶解。

2.1.3 温度对黑色素稳定性的影响 由表3可知，在40，60，80，100℃时高粱黑粉菌黑色素均保持稳定，随着时间的延长，其吸光值变化不大。表明温度的升高和加热时间的长短对高粱黑粉菌黑色素吸光值的影响不大。

图1 黑色素的形态Figure 1 The microscopic appearance of melanins

表1 黑色素的溶解性Table 1 Solubility of the melanins

表2 pH值对色素稳定性的影响Table 2 Effect of pH value on the stability of the melanins

表3 温度对黑色素稳定性的影响Table 3 Effect of temperature on the stability of the melanins

2.1.4 光照对黑色素稳定性的影响 由表4可知，随着自然光或者紫外光照射时间的增长，黑色素的吸光值出现些许增高的现象，说明光照对高粱黑粉菌黑色素具有一定增色作用。

表4 光照对黑色素稳定性的影响Table 4 Effect of light on the stability of the melanins

2.1.5 微波对黑色素稳定性的影响 由表5可知，随着时间的延长，微波处理0～30min内黑色素的吸光度几乎没有什么变化，说明微波处理对高粱黑粉菌黑色素的影响不大。

表5 微波对黑色素稳定性的影响Table 5 Effect of microwave on the stability of the melanins

2.1.6 氧化剂对黑色素稳定性的影响 高粱黑粉菌黑色素溶液中加入不同浓度的氧化剂H2O2，其吸光值变化如表6。由表6可知，高粱黑粉菌黑色素很难被H2O2氧化褪色，说明高粱黑粉菌黑色素可能具有一定的抗氧化性。

表6 H2O2对黑色素稳定性的影响Table 6 Effect of H2O2 on the stability of the melanins

2.1.7 还原剂对黑色素稳定性的影响 由表7可知，吸光值随着还原剂加入量的增加和时间的延长有显著性降低，黑色素溶液明显褪色，表明在试验条件下还原剂Na2SO3对高粱黑粉菌黑色素有明显的影响，说明此类黑色素不具有耐还原性。

表7 Na2SO3对黑色素稳定性的影响Table 7 Effect of Na2SO3 on the stability of the melanins

2.1.8 不同金属离子对黑色素稳定性的影响 由表8可知，金属离子Cu2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、A13+和Fe3+对高粱黑粉菌黑色素的稳定性都没有不良影响。但是含有Mn2+离子0.01mmol·L-1的黑色素溶液，120min后有少量褐色沉淀产生，溶液的颜色由深棕色变为了淡棕色。由此推测，当金属离子浓度变高时（0.01mmol·L-1），沉淀生产越多，黑色素稳定性越差。而在离子浓度为0.01mmol·L-1时，高粱黑粉菌黑色素的稳定性比较好。

表8 不同金属离子对黑色素稳定性的影响Table 8 Effect of different metal ions on the stability of the melanins

2.1.9 Vc对黑色素稳定性的影响 由表9可知，不同浓度的Vc对高粱黑粉菌黑色素的稳定性影响不显著，说明此类黑色素对Vc具有较好的耐受性。

2.1.10 苯甲酸钠对黑色素稳定性的影响 由表10可知，不同浓度的苯甲酸钠对高粱黑粉菌黑色素的OD值没有显著性影响，说明此条件下防腐剂苯甲酸钠对黑色素的稳定性没有影响。

2.2 黑粉菌黑色素与Cu2+络合物的红外光谱分析

高粱黑粉菌黑色素的红外光谱在3419cm-1处呈现一个宽峰，这是典型的羟基吸收带。在2924cm-1处有N-H伸展，在1629cm-1处有羧基。在1380～1240cm-1范围内的强红外波段，表明其具有吡喃环，并且存在C=O伸缩振动，1100～1240cm-1范围内有醇羟基和酚羟基（图2）。

表9 Vc对黑色素稳定性的影响Table 9 Effect of Vc on the stability of the melanins

表10 苯甲酸钠对黑色素稳定性的影响Table 10 Effect of sodium benzoate on the stability of the melanins

图2 高粱黑粉菌黑色素的红外光谱图Figure 2 UV spectrum of the melanins from S.reiliana

在不同pH值条件下，pH值分别为2.0，3.0，4.0和4.5时，Cu2+-高粱黑粉菌黑色素络合物的红外光谱图如图3。通过将图3与未与金属离子络合的高粱黑粉菌黑色素的红外谱图2相比较，可以看出Cu2+-高粱黑粉菌黑色素络合物最主要的变化在 1600～1700cm-1、700～900cm-1以及 1000～1400cm-1处。 其中，1632cm-1峰的强度增加，而在2853cm-1的位置出现一个新吸收峰。并且，随着溶液pH值的升高，1732cm-1和1271cm-1处的吸收峰的强度下降。

2.3 黑粉菌黑色素与Fe3+络合物的红外光谱分析

在不同pH值条件下（2.0，3.0，4.0和4.5），Fe3+-高粱黑粉菌黑色素络合物的红外光谱图如图4。通过将图4与未与金属离子络合的高粱黑粉菌黑色素的红外谱图2相比较，可以看出，Fe3+-高粱黑粉菌黑色素络合物最主要的变化在 1600～1700，700～900，1000～1400cm-1处。 与 Cu2+的络合物类似，Fe3+的络合物的谱图中，1632cm-1峰的强度增加，而在2853cm-1的位置出现一个新吸收峰。并且，随着溶液pH值的升高，1732cm-1和1271cm-1处的吸收峰的强度下降。

图3 不同pH值下黑粉菌黑色素与Cu2+相互作用的红外光谱图Figure 3 IR spectra of the melanins from head smut with Cu2+ions for the different pH values

图4 不同pH值下黑粉菌黑色素与Fe3+相互作用的红外光谱图Figure 4 IR spectra of the melanins from head smut with Fe3+ions for the different pH values

3 讨论与结论

高粱黑粉菌黑色素与真黑色素相似，它们的理化性质也比较接近。不溶于水和大多数有机溶剂，易溶于偏碱性的极性溶液，微溶于二甲基亚砜、甲醇。高粱黑粉菌黑色素在pH值2.0～7.0的范围内呈现棕红色，当pH值＞8.0时，黑色素的颜色变为深褐色。高粱黑粉菌黑色素具有较好的耐热性，其吸光值随温度的升高而升高，可能是高温条件下会引起黑色素的聚合，或者水浴加热过程中产生了溶剂少量挥发的现象[10-11]。光照试验推测可能是由于黑粉菌黑色素在光照条件下其聚合作用会增强，也可以初步推测高粱黑粉菌黑色素具有一定的抗紫外辐射作用[12-13]。抗氧化方面的结果，与之前文献中报道的有关其他菌种黑色素的相关结论一致[14-18]，再次验证不同菌种所产黑色素都具有一定的抗氧化功能。Cu2+在黑色素的形成过程中扮演着非常重要的角色。真黑色素形成过程中的关键酶—酪氨酸酶的活性中心部位含有一个Cu2+[19]。结合Fe3+络合的情况，推测样品中的羧基和酚羟基可能已经被离子化。

综上所述，高粱黑粉菌黑色素具有较好的耐热性，有一定的抗氧化性，但是不具备抗还原性。维生素C和苯甲酸钠对黑色素稳定性的影响不大。金属离子Cu2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、A13+和Fe3+对高粱黑粉菌黑色素的稳定性都没有不良影响。结合红外光谱我们推测，高粱黑粉菌黑色素含有OH、N-H、C=O、C=C、羧基、吡喃环、醇羟基和酚羟基。另外，比较了高粱黑粉菌黑色素与金属离子Cu2+、Fe3+络合物的红外光谱特征，发现络和溶液的pH值变化会影响与金属离子的作用。pH值对高粱黑粉菌黑色素与Cu2+离子络和的影响和高粱黑粉菌黑色素与Fe3+离子络和的影响类似。在pH值2.0～4.5时，高粱黑粉菌黑色素与两种金属离子络合物的红外光谱的改变说明金属离子与羰基发生了主要作用。随着pH值的增加，可以判断出高粱黑粉菌黑色素与金属离子发生了相互作用，因为在形成黑色素分子中存在羰基和邻位醌羟基，1732cm-1和1271cm-1处峰强度减弱，1632cm-1处峰强度增加更证明了这种作用。并且，这种相互作用可能不仅与金属离子的浓度以及溶液的pH值大小相关，而且也依赖于金属离子相互作用的邻近基团的性质。