左旋含羞草碱对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞凋亡及DNA损伤相关蛋白表达的影响

向银洲，李雪军，邹玉华，周华军

（台州市第一人民医院 耳鼻咽喉科，浙江 台州 318020）

铁是人体生命活动中不可或缺的重要元素，参与细胞呼吸、DNA合成和细胞周期代谢、细胞排毒等[1]。铁离子在氧化还原状态之间转换，产生活性氧物质，不仅损害脂质和蛋白质，还导致氧化损伤DNA[2-4]。因此，铁是细胞生理功能必不可少的物质，同时也存在潜在的毒性。铁能够通过促进形成自由基而使肿瘤的发生加速，也可以作为营养元素促进肿瘤细胞生长增殖，提示铁及铁代谢途径可能成为肿瘤治疗的新靶点。左旋含羞草碱是一种植物氨基酸，研究发现其与胸腺嘧啶的结构具有高度相似性，能够与腺嘌呤在复制点形成氢键，二者具有竞争关系[5]。左旋含羞草碱对多种肿瘤细胞的生长有抑制作用，诱导肿瘤细胞发生凋亡，并通过螯合铁离子阻断癌细胞周期进程，对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞的生长具有抑制作用，而对正常肝细胞的凋亡几乎没有影响[6-7]。本研究通过观察铁与左旋含羞草碱对咽鳞状细胞癌FaDu细胞凋亡的影响，以及DNA损伤相关蛋白在凋亡过程中的变化，探讨左旋含羞草碱促进咽鳞状细胞癌细胞凋亡的可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料 左旋含羞草碱购于美国Sigma公司；人咽鳞状细胞癌FaDu细胞株由武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科研究所提供；p-ATM鼠抗人单克隆抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；p-ATR鼠抗人单克隆抗体、p-mTOR鼠抗人单克隆抗体购于上海圣克鲁斯生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞形态学观察：人咽鳞状细胞癌FaDu细胞配制成密度为105个/mL的单细胞悬液，每孔0.5 mL， 均匀加入到6孔板中，添加适量RPMI 1640培养液，置含5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下的恒温培养箱中孵育过夜，次日取出放在倒置显微镜下观察细胞贴壁后，每孔分别加入终浓度为0、100、200、 400 μmol/L的左旋含羞草碱培养液，继续在培养箱中培养24 h、48 h后，取出放在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

1.2.2 流式细胞仪检测FaDu细胞的凋亡：选择枸橼酸铁铵的实验浓度分别为0、100、500、 1 000 μmol/L，分别加入FaDu细胞培养基中培养48 h后收集细胞。加入-20 ℃预冷70%乙醇固定细胞30 min，放进4 ℃冰箱冷藏过夜。次日取出细胞，倾去乙醇，PBS洗涤细胞3次，加入100 μmol/L 的RNA酶200 μL消化细胞，37 ℃恒温水浴箱水浴 30 min，滴加20 μmol/L碘化丙啶PI 1 mL，放进4 ℃ 冰箱并遮光染色30 min，上流式细胞仪检测枸橼酸铁铵对FaDu细胞凋亡的影响。另一组实验将处于对数生长期的FaDu细胞分为对照组，左旋含羞草碱组，终浓度为200 μmol/L（E组），枸橼酸铁铵组，终浓度分别为50 μmol/L（A组），100 μmol/L（B组），左旋含羞草碱+枸橼酸铁铵组，终浓度分别为左旋含羞草碱200 μmol/L+枸橼酸铁铵50 μmol/L（C组），左旋含羞草碱200 μmol/L+枸橼酸铁铵100 μmol/L（D组），培养48 h后收集细胞，-20 ℃预冷的70%乙醇固定细胞30 min，放进4 ℃冰箱过夜。次日取出细胞，按上述方法检测枸橼酸铁铵、左旋含羞草碱对FaDu细胞凋亡的影响。以上实验每组设3个复孔，以0.9%氯化钠溶液作为空白对照，实验重复3次。

1.2.3 CCK-8检测FaDu细胞活性：FaDu细胞制成单细胞悬液，计数板进行细胞计数，将细胞配成104个/mL 的细胞悬液，按150 μL、1 500个/孔的标准将细胞接种于96孔板，放置到含5% C02、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养24 h，按上述分组，并设置阴性对照孔，每种浓度均设3个复孔。测定每孔pH后放入培养箱培养待用。分别于培养24 h、48 h、72 h、96 h时取出培养板加入CCK-8试剂10 μL继续培养 2 h，酶标仪测450 nm处OD值，并按照以下公式计算细胞生长抑制率:肿瘤细胞的抑制率（%）=（对照孔OD值-实验孔OD值）/对照孔OD值×100%[8]。每次实验重复3次，并描绘细胞生长曲线。

1.2.4 Western blot法检测p-ATR、p-histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR等DNA损伤相关蛋白的表达：将FaDu细胞制成单细胞悬液，进行细胞计数，以每瓶105个细胞接种于100 mL培养瓶内，放5% CO2、 37 ℃、饱和湿度的孵箱内培养。培养24 h后，见细胞贴壁生长，加入左旋含羞草碱，终浓度分别为0、100、200、400 μmol/L，继续培养24 h，收集细胞，离心5 min，倒去上清液，PBS液洗涤3次，分别转移到1.5 mL Ep管中，100 μL蛋白质裂解液Buffer被加入EP管处理细胞，-20 ℃冰箱保存待测。次日10% SDS-PAGE处理细胞样品，SDS聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质被转移到硝酸纤维素膜上，4 ℃冰箱封闭过夜。次日取出硝酸纤维素膜放进含一抗抗体的封闭液中，4 ℃冰箱孵育过夜。次日取出膜电转液洗涤3次，每次10 min。将膜放入含辣根酶标记的相应IgG二抗抗体的封闭液中，室温下孵育2 h，电转液洗涤3次，每次10 min。最后将膜放在保鲜膜 上，电化学发光法检测p-ATR、p-Histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR蛋白的表达水平。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料采用表示，多个样本均数之间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察培养了24 h、48 h的人咽鳞状细胞癌FaDu细胞的生长状况，见细胞贴壁生长，连接紧密，密集成片生长，轮廓欠清，透明度大，折光性强，大小均匀。经不同浓度的左旋含羞草碱作用后，可见两种细胞相互离散，细胞皱缩，体积变小，间隙增宽，细胞固缩深染，折光性减弱，细胞数目明显减少。随着左旋含羞草碱浓度的增加和作用时间的延长，培养瓶中悬浮细胞增多，贴壁生长的细胞减少，培养液变浑浊。

2.2 流式细胞仪检测FaDu细胞的凋亡 枸橼酸铁铵（浓度分别为0、100、500、1 000 μmol/L）分别干预FaDu细胞48 h，流式细胞仪检测细胞的凋亡率分别为（1.75±0.31）%、（ 1.07±0.28）%、（ 2.12± 0.42）%、（ 2.46±0.49）%，结果显示FaDu细胞在100 μmol/L枸橼酸铁铵作用下，其凋亡率低于对照组；500、1 000 μmol/L枸橼酸铁铵作用下，FaDu细胞的凋亡率则高于对照组，与100 μmol/L的枸橼酸铁铵组比较，细胞凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。对照组和A-E组的细胞凋亡率分别为（1.78±0.33）%、（ 1.19±0.27）%、（ 1.09±0.25）%、（1.81±0.32）%、（ 1.71±0.30）%、（ 2.95±0.52）%，E组FaDu细胞凋亡最显著，C组和D组与对照组相比，细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；A组和B组与对照组比，细胞凋亡率减低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 CCK-8检测FaDu细胞的活性 将处于对数生长期的人咽鳞状细胞癌FaDu细胞分组培养后，在24 h、48 h、72 h、96 h取出检测细胞的活性，结果发现E组对FaDu细胞生长的抑制作用最显著，然后为C组、D组，与对照组比差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.4 左旋含羞草碱对FaDu细胞p-Histone-H2AX、p-ATR、p-ATM、p-mTOR蛋白表达的影响 FaDu细胞接种于100 mL培养瓶内培养，分别加入含左旋含羞草碱浓度为0、100、200、400 μmol/L的培养液培养24 h 后收集细胞，Western blot检测不同浓度左旋含羞草碱对人咽鳞状细胞癌FaDu细胞DNA损伤相关蛋白表达的影响。结果显示，随着左旋含羞草碱浓度的递增，p-ATR蛋白的表达降低，p-Histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR蛋白的表达增强，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。见表1。

图1 不同浓度枸橼酸铁铵对FaDu细胞凋亡的影响

图2 左旋含羞草碱联合枸橼酸铁铵对FaDu细胞凋亡的影响

图3 CCK-8检测左旋含羞草碱联合枸橼酸铁铵对FaDu细胞活性的影响

3 讨论

肿瘤细胞表面存在较多转铁蛋白受体，这使转铁蛋白可能成为化疗药物治疗肿瘤的靶点。有实验将点突变的白喉毒素与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体结合形成复合物，形成内吞囊泡而转移进入肿瘤细胞内，从而选择性地杀死肿瘤细胞；另一方面，白喉毒素与肿瘤细胞表面的转铁蛋白受体结合，使转铁蛋白受体丧失了原来的功能，影响了肿瘤细胞铁代谢，导致肿瘤细胞死亡。以转铁蛋白或转铁蛋白受体为靶点的化疗药物在体外细胞实验和活体实验中都显示出对肿瘤细胞较好的细胞毒性[9]。

铁螯合剂通过螯合细胞内铁影响了癌细胞生物学行为，抑制了核糖核苷酸还原酶活性，进而影响 DNA的合成和修复；降低了细胞周期蛋白CyclinA、CyclinB、CyclinD的表达，增加了细胞周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs）抑制剂、P27Kip1的表达，降低了CDK2的表达，降低了Rb磷酸化水平和上调p53基因和代谢抑制基因NDRG1的表达，还影响缺氧诱导因子α（hypoxia inducible transcription factor α，HIF-α）的表达。铁螯合剂能够上调DNA损伤诱导基因（GADD）家族诸多成员mRNA水平和蛋白水平，抑制肿瘤细胞的生长[10]。FaDu细胞在100 μmol/L枸橼酸铁铵作用下，细胞的凋亡率低于对照组；500、1000 μmol/L枸橼酸铁铵作用下，FaDu细胞的凋亡率则高于对照组，与100 μmol/L枸橼酸铁铵组比较，细胞凋亡率有显著性差异，表明一定量的枸橼酸铁铵对FaDu细胞的凋亡具有抑制作用，缺铁或铁过量对细胞凋亡具有促进作用。左旋含羞草碱能够促进FaDu细胞的凋亡，加入适量的枸橼酸铁铵后，左旋含羞草碱促进FaDu细胞凋亡的作用基本消失。CCK-8法检测FaDu细胞的活性，结果显示左旋含羞草碱单独作用于FaDu细胞，其抑制细胞生长作用显著，加入一定量的枸橼酸铁铵后，其抑制FaDu细胞生长的作用明显减弱。这些实验表明左旋含羞草碱诱导人咽鳞状细胞癌细胞凋亡的作用是通过干扰癌细胞的铁代谢来实现的，表现出铁螯合剂的作用。与KULP等[7]的左旋含羞草碱通过铁螯合作用阻断人乳腺癌细胞周期进程，发挥其抗肿瘤作用的研究结果基本一致。

表1 左旋含羞草碱对FaDu细胞p-Histone-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-mTOR蛋白表达的影响

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于酵母和哺乳动物体内，在调节细胞的生长、增殖、细胞周期等方面发挥着重要的作用[11]。在许多肿瘤中，mTOR信号通路的异常改变是最常见的病理变化之一，mTOR信号通路过度激活可导致癌细胞的异常生长、增殖和存活[12]。因此mTOR信号途径的失调与恶性肿瘤的发生发展有着紧密的联系。实验研究发现，p-mTOR在咽鳞状细胞癌组织中的表达与左旋含羞草碱作用浓度呈显著正相关，推测左旋含羞草碱促进咽鳞状细胞癌细胞凋亡可能通过AKT/mTOR信号通路来实现。

DNA损伤是指在DNA复制过程中，外源性和内源性的因素引起核苷酸序列发生了永久性变化，从而导致了遗传特征的改变，其损伤形式多样，双链断裂是DNA损伤的一种类型[13]。抑癌基因ATM（ataxia telangiectasia mutated kinase）在DNA双链损伤时，阻止细胞进入有丝分裂期而发挥抑癌作用。 p-ATM（phospho-ATM protein）是Ser1981磷酸化的ATM蛋白，主要感应和识别内源性和外源性诱变因子造成的DNA双链断裂损伤[14]。DNA双链断裂能够促使ATM发生自动磷酸化，从而激活ATM激酶[15]，因此p-ATM的表达水平与DNA双链断裂损伤的状况相关。实验中，随着左旋含羞草碱作用浓度的增加，p-ATM蛋白表达增强，说明双链断裂引起的DNA损伤加剧，左旋含羞草碱可能通过对细胞铁代谢的干扰，导致DAN双链断裂，引起DNA损伤，促进了FaDu细胞的凋亡。

组蛋白H2AX在细胞的DNA损伤修复、基因组稳定性的维持、细胞周期检测点调控和肿瘤生长的抑制中发挥极其重要的作用，尤其是检测H2AX的磷酸化过程中形成的γ-H2AX，在评估DNA损伤中具有很大的价值[16]。而DNA双链断裂位点H2AX的迅速磷酸化，是DNA损伤诱导的早期应答。本实验发现p-Histone-H2AX的表达与左旋含羞草碱的浓度呈正相关，进一步提示左旋含羞草碱可能通过调控细胞铁代谢诱导人咽鳞状细胞癌FaDu细胞DNA的双链断裂损伤，从而导致染色质断裂、细胞突变，最终引起细胞凋亡。

左旋含羞草碱可能通过干扰人咽鳞状细胞癌细胞的铁代谢，调控AKT/mTOR等信号通路，引起细胞DNA的双链断裂损伤，发生细胞突变，导致肿瘤细胞凋亡。