衍生物Fla-CN 的抗糖尿病作用及其作用机制研究

寇川，梁艳，张畅，秦楠，段宏泉，陈莹

（天津医科大学药学院天然药物化学系，天津300070）

糖尿病的发病原因错综复杂，但是临床上都具有一个共同特征：血糖的病理性升高。慢性高血糖症导致易感组织的病理损伤，并可能最终导致继发性并发症，如视网膜病变、肾病和神经病变、心血管疾病和卒中[1-3]。通常，胰岛素的释放减少和作用受到抑制会导致糖异生作用增加，糖摄取降低，从而导致血糖水平升高。肝脏在维持2 型糖尿病的葡萄糖稳态中起重要作用。当血糖升高时，肝脏会增强肝脏对葡萄糖的吸收，吸收糖原存储，合成脂肪酸并改善胰岛素敏感性。因此，改善肝葡萄糖代谢稳态可能是治疗2 型糖尿病的潜在策略。

3-O-[（E）-4-（4-cyanophenyl）-2-oxobut-3-en-1-yl] kaempferol（Fla-CN）是委陵菜黄酮Tiliroside 的衍生物，通过激活AMP 活化蛋白激酶（AMPK），增强HepG2 细胞的葡萄糖消耗[4]。本课题组以高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型为研究对象，发现Fla-CN不仅具有抗肥胖作用，而且可提高肥胖小鼠的胰岛素敏感性[5]。糖尿病C57BL/KsJ-db/db 小鼠是瘦素受体基因突变导致的，是目前广泛应用于研究人类2型糖尿病的动物模型之一[5-6]。本研究旨在以2 型糖尿病模型db/db 小鼠为研究对象，评价Fla-CN 对糖代谢的调节作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 黄酮衍生物Fla-CN 化合物Fla-CN 的结构（图1）通过1H、13C NMR 和2D NMR 波谱数据分析确定，包括COSY、HSQC、HMBC 和ROESY 光谱。通过HPLC 分析Fla-CN 的纯度≥95%。

图1 Fla-CN 的化学结构Fig 1 The chemical structure of Fla-CN

1.2 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2 细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。细胞培养于10%胎牛血清100 IU/mL 青霉素、0.1 mg/mL 链霉素的α-MEM 培养基中，置CO2培养箱中，于37℃、5%CO2条件下培养。在显微镜下观察、计数，根据实验需要，调整细胞密度，接种于培养瓶或培养板中，同样条件下继续培养，待细胞融合形成连续单层后即可用于实验。

1.3 葡萄糖生成测定 取对数生长期的HepG2 细胞接种于6 孔板，细胞密度为2×105个细胞/孔，培养24 h 后，弃去原培养基，PBS 洗2 次，更换为无血清培养基，加入Fla-CN（1、2、5 和10 μmol/L）及二甲双胍（1 mmol/L），同时设立空白对照组，孵育24 h。用PBS 洗涤两次以除去葡萄糖，然后更换葡萄糖生成测定培养基（含有1 mmol/L 丙酮酸钠，20 mmol/L乳酸钠和15 mmol/L HEPES 的无葡萄糖和酚红的DMEM），温育4 h[7-8]。使用Amplex Red Glucose /葡萄糖氧化酶测定试剂盒（Sigma，St.Louis，USA），取上清液用于测量葡萄糖浓度。通过Thermo Scientific BCA 蛋白测定试剂盒测定细胞蛋白浓度。

1.4 葡萄糖摄取测定 取对数生长期HepG2 细胞以3×105个细胞/孔的密度接种到6 孔板中，待12 h贴壁后，加入不同浓度Fla-CN，预留空白对照组、阳性对照组（Ins 组）。24 h 后，PBS 洗3 遍，更换为无糖无血清的DMEM 培养基饥饿3 h，PBS 洗2 遍，每孔加入300 μL 的无糖无血清DMEM 培养基，同时加入1.5 μL 浓度为20 mmol/L 的2-NBDG，阳性对照组加入100 nmol/L 短效人胰岛素，作用30 min。实验结束，消化细胞，收集细胞至Ep 管中，5 000 r/min（离心半径6.2 cm）4℃离心5 min，小心吸弃上清液，同时加入200 μL PBS 重悬细胞沉淀，于荧光酶标仪激发波/发射波为488/520 nm 的条件下读取数值。

1.5 糖原含量测定 将对数生长期HepG2 细胞接种到6 孔板中，待12 h 贴壁后，吸弃旧培养基，PBS洗2 遍，每孔分别加入无血清高糖DMEM 培养基以及Fla-CN（1、2、5 和10 μmol/L）及胰岛素（100 nmol/L），24 h 后吸弃上清液，消化细胞，收集细胞，在30%KOH 中匀浆。将样品煮沸20 min，加入1.5 mL 乙醇，然后以12 000 r/min（离心半径6.2 cm）离心15 min。将沉淀物溶于0.5 mL 蒸馏水中，并加入0.2%的蒽酮（用98%的硫酸稀释）稀释后煮沸20 min。在620 nm 处检测并记录OD 值，通过Thermo Scientific BCA 蛋白测定试剂盒测定细胞蛋白浓度。

1.6 动物与干预 C57BL/KsJ-db/db 和C57BL/KsJ-db/m 雄性小鼠42 只，SPF 级，6～8 周龄，由南京大学模型动物研究中心提供[批号：SCXK（苏）2018-0008]。小鼠饲养于天津市南开医院动物实验中心[饲养许可证号：SYXK（津）2015-0007]，按照SPF 饲养标准适应性喂养1 周，期间自由进食、进水。1 周后称重并按照随机数字表法随机分组。以C57BL/KsJ-db/m 小鼠为对照组，灌胃给予生理盐水（db/m）。C57BL/KsJ-db/db 小鼠根据体重和血糖水平按照随机数字表法随机分为不同的治疗组。为期4 周的研究分组如下：db/db（生理盐水溶液）、Fla-CN 高剂量组（Fla-CNH）、中剂量组（Fla-CNM）及低剂量组（Fla-CNL），给药剂量分别为15 mg/kg、8 mg/kg、2.3 mg/kg，阳性对照组给予盐酸二甲双胍150 mg/kg。灌胃，每天1 次。在研究结束时，所有小鼠禁食12 h。在处死之前收集空腹血液以测量空腹血糖。将组织和血清保持在-80℃直至进一步分析。

1.7 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和腹腔内胰岛素耐量试验（IPITT） 禁食过夜的动物在第12 周末通过口服2 g/kg 葡萄糖进行OGTT，固定小鼠，75%医用酒精对尾部消毒后，剪尾0.5 mm 让血液自然滴于血糖试纸上，测量空腹血糖水平，记为OGTT 试验0 min 血糖水平。给予20%葡萄糖灌胃后，记录小鼠在30、60、90 和120 min 血糖水平，绘制血糖曲线，计算血糖-时间曲线下面积。

IPITT 在间隔3 d 后进行。小鼠禁食2 h，鼠尾取血记录血糖水平，记为0 min 血糖水平，腹腔注射0.75 IU/kg 人短效胰岛素。胰岛素注射后记录30、60、90 和120 min 血糖浓度。绘制血糖曲线，计算血糖-时间曲线下面积。

1.8 免疫印迹 细胞达到汇合后，将培养基替换为补充有0.2%BSA 的DMEM。12 h 后，除去培养基，并加入含有不同浓度的Fla-CN 和（或）20 μmol/L AICAR 和（或）20 μmol/L compound C 的培养基。孵育24 h 后，使用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白质和核蛋白。将肝组织在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的冰冷RIPA 缓冲液中匀浆。将组织匀浆离心[13 000 r/min（离心半径6.2 cm），20 min，4℃]，并将上清液用于蛋白质印迹分析。通过Thermo Scientific BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质样品（60 μg/泳道），并转移至PVDF 膜（Millipore，Bedford.MA）。将膜用含10%脱脂奶粉的的TTBS 封闭1 h，并在4℃下与磷酸化AMPK、磷酸化乙酰辅酶A 羧化酶（p-ACC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK），葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ 协同刺激因子1α（PGC-1α）、AMPK 和β-肌动蛋白（β-actin）孵育过夜。TTBS 洗3 次，每次10 min。之后，辣根过氧化物酶耦联的二抗孵育1 h。通过使用增强的化学发光Western 印迹检测系统（GE Healthcare Life Sciences，英国）对条带进行可视化。应用NIH Image J 软件分析，进行定量分析。所有抗体均购自Cell Signaling Technology。

2 结果

2.1 Fla-CN 对肝HepG2 细胞糖代谢的影响 如图2A 所示，研究首先观察了Fla-CN 对HepG2细胞中葡萄糖摄取的影响。HepG2 细胞分别与Fla-CN（1、2.5、5、12.5 μmol/L）以及胰岛素（100 nmol/L）孵育后，与对照组相比，5、12.5 μmol/L 的Fla-CN以及胰岛素均显著增加了肝细胞对2-NBDG 的摄取（F=33.50，P＜0.01）。

研究通过蒽酮法测定HepG2 细胞内糖原含量，结果如图2B 所示，与对照相比，胰岛素刺激后HepG2细胞内的糖原含量显著增加。不同浓度的Fla-CN孵育的HepG2 细胞内糖原含量呈剂量依赖性增加，其中浓度分别为5、12.5 μmol/L（F=93.63，P＜0.01）的Fla-CN 明显提高细胞内的糖原含量。

Fla-CN 呈剂量依赖性的抑制肝葡萄糖产生（F=44.19，P＜0.01，图2C）。同时Fla-CN 对HepG2细胞内乳酸含量无显著影响（数据未显示）。

图2 Fla-CN 对肝细胞HepG2 细胞内糖摄取、糖原合成以及糖异生过程的影响Fig 2 Effect of Fla-CN on hepatic glucose uptake,glycogen synthesis and gluconeogenesis in HepG2 cells

2.2 Fla-CN 对2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖、口服糖耐量和胰岛素耐量的影响 如图3A 所示，在实验结束时，模型组db/db 小鼠的空腹血糖明显高于对照组db/m 小鼠。与模型组相比，Fla-CNH 组空腹血糖水平显著降低（t=3.853，P＜0.05）。在OGTT（图3B）和IPITT（图3D）中，Fla-CN 干预组各个时间点血糖浓度均低于该时间点模型组的血糖浓度。在OGTT 中，与db/m 相比，模型组db/db 的曲线下面积显著增加（t=104.6，P＜0.001）；而与db/db 组相比，Fla-CNH 组和二甲双胍组（F=98.40，P＜0.05）曲线下面积则明显降低（图3C、E）。

图3 Fla-CN 对2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量实验及其时间-血糖曲线下面积、胰岛素耐量实验及其时间-血糖曲线下面积的影响Fig 3 Effects of Fla-CN on fasting blood glucose,oral glucose tolerance and its AUC,insulin tolerance and its AUC in mice

2.3 Fla-CN 对2 型糖尿病db/db 小鼠肝脏和肌肉组织AMPK 磷酸化的影响 如图4 所示，与db/db组相比，不同剂量Fla-CN 均上调db/db 小鼠肝脏组织和肌肉组织中磷酸化AMPK 蛋白表达，并呈现浓度依赖性。同时，各给药组小鼠肝组织和肌肉组织中AMPK的总水平没有显著变化。故与2 型糖尿病模型db/db组相比，肝脏组织Fla-CN 与二甲双胍治疗组的磷酸化AMPK/AMPK 比例明显提高（F=134.7，P＜0.01），在肌肉组织中也观察到Fla-CN 与二甲双胍治疗组磷酸化AMPK/AMPK 比例显著提高（F=40.47，P＜0.05）。

图4 Fla-CN 对2 型糖尿病db/db 小鼠肝脏和肌肉组织中AMPK 磷酸化的影响Fig4 Effect of Fla-CN on AMPK phosphorylation in liver and muscle of db/db mice

2.4 Fla-CN 对2 型糖尿病db/db 小鼠肝组织糖异生的影响 Western 印迹（图5）结果显示，db/db 组中PEPCK（t=51.53，P＜0.001）、G6Pase（t=19.47，P＜0.001）的蛋白表达显著增加，PGC-1α 的蛋白表达也明显升高（t=36.95，P＜0.001）。而Fla-CN 则明显抑制PEPCK（F=54.20，P＜0.001）、G6Pase（F=36.79，P＜0.001）和PGC-1α（F=44.78，P＜0.05）的蛋白表达。

2.5 Fla-CN 通过AMPK 激活抑制糖异生 为了确认衍生物Fla-CN 是否通过激活AMPK 调节糖异生过程，实验采用Fla-CN（12.5 μmol/L）结合AMPK抑制剂Compound C（4 μmol/L）和激活剂AICAR（0.1 mmol/L）处理HepG2 细胞。如图6A 所示，Fla-CN 显著增加了AMPK 的磷酸化，这种作用被Compound C 阻断。Fla-CN 和AICAR 都显著下调了HepG2 细胞中PEPCK、G6Pase 和PGC-1α 的蛋白表达。此外，与Fla-CN 组相比，Fla-CN 和Compound C共同孵育对PEPCK（t=24.82，P＜0.01）、G6Pase（t=4.673，P＜0.05）和PGC-1α（t=10.58，P＜0.01）的抑制作用减弱。

图5 Fla-CN 对2 型糖尿病db/db 小鼠肝组织糖异生过程中G6Pase,PEPCK and PGC-1α 蛋白表达的影响Fig 5 Effect of Fla-CN on the protein expression of G6Pase,PEPCK and PGC-1α in the liver of db/db mice

图6 Fla-CN 通过AMPK 信号通路对肝糖异生的抑制作用Fig 6 Fla-CN exerts an inhibitory effect on hepatic gluconeogenesis via the AMPK signaling pathway

3 讨论

血糖稳态是机体通过调节内源性葡萄糖的产生以及对胰岛素敏感的外周组织的葡萄糖摄取来实现的。正常机体摄食后，胰岛素抑制肝脏中糖异生和糖原分解，并增强周围组织对血液中葡萄糖的利用，如糖原合成、糖酵解等。然而，在2 型糖尿病患者体内，肝脏的糖异生明显增加、糖原合成降低；血液中葡萄糖的摄取作为骨骼肌、肝脏等组织对葡萄糖利用的起始，在机体胰岛素抵抗情况下受到抑制[10]。这些变化导致葡萄糖的生成率超过血液循环中葡萄糖的清除率，引起血液循环中血糖升高[11]。近年来，在对2 型糖尿病的药物研发中，寻找能够调节葡萄糖代谢、恢复血糖稳态的活性天然产物已经成为治疗2 型糖尿病药物研发的热点。据报道，小檗碱[12]、山奈酚[13]、人参皂甙[7,14]等能够抑制肝葡萄糖生成，促进葡萄糖摄取而表现出降血糖的作用。本研究发现，黄酮衍生物Fla-CN 在一定浓度范围内能够显著增加肝HepG2 细胞对葡萄糖的摄取，抑制糖异生，促进糖原合成，提示Fla-CN 在调节糖代谢中具有重要作用。体内实验进一步显示，Fla-CN 能够明显降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖，改善db/db 小鼠受损的糖耐量和胰岛素耐量，这些结果证明Fla-CN 具有显著调节葡萄糖稳态，有效提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗的作用。

AMPK 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是由α、β 和γ 亚基组成的异源三聚体，能够维持细胞能量平衡。外周组织如骨骼肌、肝脏和脂肪组织中AMPK 的激活能够加快新陈代谢，改善胰岛素敏感性，有利于2 型糖尿病的预防和治疗。AMPK 复合物不仅可以感知细胞中AMP 和ATP 的比例，而且细胞内糖原含量的改变可影响AMPK 的活性，所以AMPK 被认为是细胞能量代谢状态和能量储备状态的感受器[15]。骨骼肌是机体餐后摄取葡萄糖的主要器官，能够摄取80%餐后升高的血糖，对维持血糖稳态发挥重要作用。研究表明，葡萄糖的摄取必须借助跨膜蛋白葡萄糖转运蛋白（GLUT）的转位来完成。目前已经发现的GLUT 有14 种，分别是GLUT 1～14，这些GLUTs 分布在机体不同组织。其中由SLC2A4 基因编码的GLUT4 是细胞葡萄糖摄取率的决定因素，它与2 型糖尿病的代谢异常密切相关。激活的AMPK 可以导致其底物AS160 磷酸化，降低AS160 的Rab-GTP 酶活性，刺激GLUT4 由细胞内转位至细胞膜，促进葡萄糖的摄取[16-17]。降糖药物二甲双胍作为临床一线药物，通过促进外周组织对葡萄糖的摄取和利用，维持血糖稳定。研究发现，二甲双胍是一种AMPK 激动剂，主要通过激活AMPK 发挥其降糖作用[18-19]。本研究结果显示，Fla-CN 处理后显著增加了糖尿病db/db 小鼠肝脏和肌肉组织中AMPK 的磷酸化，表明Fla-CN 可能通过激活AMPK 促进葡萄糖摄取。

另一方面，肝脏中AMPK 的激活可有效抑制糖异生关键酶PEPCK 和G6Pase 的表达，进而抑制肝脏糖异生，降低葡萄糖生成[20]。而肝AMPK 特异性敲除小鼠后显示糖耐量受损以及空腹高血糖，这可能是由于PEPCK 和G6Pase 活性增加，从而肝脏糖异生增加[21]。PGC-1α 是一种转录共激活因子，参与调节细胞能量代谢的多个方面，在1 型和2 型糖尿病中，PGC-1α 的基因表达水平均显著升高。由腺病毒介导在大鼠肝脏过表达PGC-1α，其原代肝细胞和禁食动物肝脏中观察到激活的PGC-1α 参与糖异生的整个过程。重要的是，在原代肝细胞中观察到葡萄糖分泌增加，而大鼠禁食后体内葡萄糖水平升高[22]。因此，肝脏中PGC-1α 活性升高很可能导致糖尿病的高血糖症。最近的研究表明，PGC-1α 也是肝细胞核受体4α（HNF4α）和叉头框蛋白O1（FOXO1）的辅激活因子，调控糖异生关键酶PEPCK 和G6Pase 的活性[23-25]。有研究报道，AMPK 可能导致共激活因子PGC-1α 的表达下调，进而抑制PEPCK 和G6Pase 的表达[9]。在本研究中，2 型糖尿病小鼠的肝组织和HepG2 肝细胞中，Fla-CN 显著激活AMPK，同时抑制PEPCK、G6Pase 和PGC-1α 的表达，这可能是Fla-CN 降低db/db 小鼠空腹血糖，抑制肝细胞糖异生的作用机制。为了进一步证实AMPK 在Fla-CN调节糖异生过程的作用，研究采用AMPK 抑制剂（Compound C）来阻断Fla-CN 诱导的AMPK 活化作用。笔者发现Compound C 可以阻止AMPK 的活化，并且削减了Fla-CN 对PEPCK、G6Pase 和PGC-1α蛋白表达的抑制作用，表明AMPK 在Fla-CN 的调控糖异生过程机制中起关键作用。

本研究表明，黄酮衍生物Fla-CN 具有调节肝HepG2 细胞糖代谢的作用，并且能够显著降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖，改善其受损的糖耐量，提高胰岛素敏感度。进一步研究显示，Fla-CN 可以通过激活AMPK 调节糖摄取和肝糖异生，从而发挥抗糖尿病作用。