紫花苜蓿（Medicago sativa）高效根瘤菌菌剂研究

杨瑾瑾 王宏伟 刘朋飞

摘要 基于已获得高效紫花苜蓿根瘤菌菌株的基础上，以生产紫花苜蓿根瘤菌的固体粉剂和液体菌剂为研究对象，分别对生产菌剂所需的载体和添加剂、菌剂保存所需的菌剂含水量及保存温度进行研究。结果表明，生产固体菌剂的最佳载体为含水量10%的高岭土，添加剂为1.0%的PVP，保存溫度为4 ℃;液体菌剂的添加剂为共同添加1.0%海藻糖、5.0%PVP和10.0%蔗糖最佳。后经过结瘤试验验证，2种剂型都可促使紫花苜蓿高效结瘤，结瘤率达到更高，为95%;紫花苜蓿种子经过消毒处理较对照可使单株结瘤量提高72.4%。通过菌剂接种紫花苜蓿的田间试验产量统计，发现施加液体菌剂和固体菌剂，紫花苜蓿产量较对照分别提高21.9%和24.2%，结瘤率分别提高66.7%和67.1%，说明该研究获得的紫花苜蓿根瘤菌菌剂具有较好的田间增产效果。

关键词 根瘤菌;紫花苜蓿;剂型;载体;添加剂

Abstract Based on the highefficiency rhizobium strains of Medicago sativa，taking solid powder and liquid bacteria for the production of alfalfa rhizobium as research objects，the carrier，additives，water content of the bacteria needed for the preservation of the bacteria and conserve temperature were studied respectively.The results showed that the best carrier for producing solid bacteria was kaolin with a water content of 10%，the addition of 1.0% PVP，and the 4 ℃ storage temperature;while the addition of 1.0% trehalose，5.0% PVP with ，10.0% sucrose was better for liquid inoculum.After nodulation test verification，both inoculums of rhizobia fertilizer could promote the nodulation rate of the plant，up to 95% in laboratory，in addition，the individual plants increase by 72.4% with sterilized alfalfa seeds inoculating.According to the field test yield statistics of inoculating Medicago sativa with the inoculum，it was found that the yield of Medicago sativa was increased by 21.9% and 24.2%，respectively，compared with the control，and the nodulation rate increased by 66.7% and 67.1%，this confirmed that rhizobia agent of Medicago sativa obtained by this study have efficient yield in farming production.

Key words Rhizobium;Medicago sativa;Inoculant;Carrier;Additives

紫花苜蓿（Medicago sativa）是豆科多年生草本植物，根系发达，枝叶茂密，含有丰富的粗蛋白质等营养物质，是一种优良的饲用作物[1]。受三聚氰胺事件影响，我国进口紫花苜蓿数量逐年递增，国际市场竞争力薄弱。随着2012年中央1号文件提出振兴奶业，发展紫花苜蓿草业以来，我国苜蓿草产业得到了长足发展[2-3]。

大量研究证实，施用根瘤菌菌剂可增加紫花苜蓿的结瘤数，较其自然生长状态可加倍提高紫花苜蓿的结瘤固氮效率，从而更好地提供生长所需的氮素营养，并同时改善了苜草品质。国外种植豆科作物普遍接种根瘤菌菌剂，而我国，由于农业生产技术落后，紫花苜蓿的种植接种根瘤菌较少，由于苜蓿为低产值作物，因此实际生产时基本不施用任何肥料，从而造成产量低下的现象[4]。紫花苜蓿和根瘤菌的共生专一性很强，根瘤菌接种剂的效果受当地气候和土壤环境的影响，往往效果不理想，所谓的广谱性根瘤菌菌剂是不现实的。因此因地制宜地研究适合特定土壤的根瘤菌接种剂是解决这一问题的关键。河北省是种植紫花苜蓿大省，一年可刈割4次，但是却缺乏种植紫花苜蓿的根瘤菌菌剂，据实地研究调查发现，紫花苜蓿生产企业基本不施用根瘤菌接种剂。通过多年紫花苜蓿根瘤菌的筛选研究[5-6]，在河北地区筛选到一株高效紫花苜蓿根瘤菌菌株——中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1，专利号ZL 201510066380.3），该研究以此高效根瘤菌菌株为菌剂生产菌株，拟进行紫花苜蓿接种所适宜的剂型——固体菌剂和液体菌剂的生产，对菌剂所需的载体和添加剂、保存温度及保存的含水量进行研究，并最终通过结瘤试验和菌剂田间试验，验证其施用效果，为河北省的紫花苜蓿生产提供根瘤菌菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1，专利号ZL 201510066380.3）。

1.1.2 菌剂载体。采用2种载体进行测试，玉米秸秆采自农田（后经干燥粉碎），高岭土购自河北省石家庄市灵寿健石高岭土有限公司。

1.1.3 植物种子。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中苜一号，购自中国农业科学院。

1.2 试验地概况

田间试验于河北省张家口市北方学院实验基地进行，年平均气温-0.6～9.6 ℃，无霜期80～150 d，日平均气温≥10 ℃积温1 320～3 650 ℃·d;年平均降雨量405 mm，平均日照时数大约2 700 h;土质属栗钙土。

1.3 方法

1.3.1 中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1）生长曲线的绘制。将经活化后的菌株接种在YMA液体培养基（甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，K2HPO4 0.25 g/L、KH2PO4 0.25 g/L、MgSO40.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、琼脂粉14 g/L，pH 6.8～7.2） 中，于28 ℃、180 r/min下振荡培养，每隔3 h取样测定OD值。以OD值为纵坐标、时间为横坐标绘制生长曲线。

1.3.2 固体菌剂的制作及载体类型的选择。

载体以高岭土和玉米秸秆为原料。将玉米秸秆烘干粉碎，过80目筛、烘干;高岭土烘干，将2种载体（玉米秸秆∶高岭土）按照5种不同比例（1∶0、1∶3、1∶1、3∶1、0∶1）混匀，之后干热灭菌备用。取发酵菌液10 000 r/min离心收集菌体，并用生理盐水洗涤一次，用pH 7.0磷酸缓冲液悬浮菌体，使加入载体后含水量达到饱和持水量的10%。将悬浮的菌液注入装有不同配比的载体袋（20 cm×10 cm）中，混匀封口室温保存80 d，每隔20 d 抽样一次，按照中华人民共和国农业行业标准对根瘤菌肥料进行菌剂活菌数的测定[7]。

1.3.3 固体菌剂饱和持水量及保存湿度的确定。

选用优化后的载体配比，进行干热灭菌，加入磷酸缓冲液使其达到载体饱和持水量，从而测定各个载体类型的饱和持水量。干燥载体注入菌液后，并设定3个菌剂含水量梯度：5%、10%、15%（占饱和持水量），密封室温保存80 d，20 d抽样一次，并进行菌剂活菌数测定。

载体的饱和持水量（X）计算公式：X=W3-W2-W1W2×100%，式中，W1为用滤纸将漏斗衬好加入足量蒸馏水让其自然渗漏至不再渗漏为止，漏斗及滤纸装置的总重;W2为称取的载体重量;W3为向称取的载体中加入足量蒸馏水让其自然渗漏至不再渗漏为止，此时漏斗及载体等装置的总重[8]。

1.3.4 固体菌剂保存温度的确定。

将制作好的菌剂分成两组，A组在室温阴凉干燥处保存，B组4 ℃冷藏保存80 d，20 d 抽样一次，并进行菌剂活菌数测定。

1.3.5 固体菌剂添加剂的选择。菌剂在保存和应用过程中干燥和低温会使细胞膜脱水、结晶造成不可逆的损伤。在载体内加入一些添加剂有利于提高菌活数，延长保质期。该研究选择海藻糖[9]和PVP（聚乙烯吡咯烷酮）[10]2种添加剂分别进行不同适宜含量的研究，海藻糖的添加浓度为0.5%、1%和2%，PVP为1%、5%和10%。将加添加剂的固体菌剂在室温保存80 d，每20 d抽样一次，并进行菌剂活菌数的测定。

1.3.6 液体菌剂的制作和添加剂的确定。

在液体菌剂中，添加剂的使用可保证其相对稳定的菌活数，所以液体菌剂选择了4种添加剂（海藻糖、PVP、甘油和蔗糖）进行测试，设置3个浓度水平进行正交试验。

配制PBS缓冲液（0.2 mol/L NaH2PO4与0.2 mol/L Na2HPO4按38∶62的比例混匀，加入8 g/L的NaCl），分别添加各种配比的添加剂，加入离心收集的菌体，离心管4 ℃冰箱封口保存80 d，20 d抽样一次进行活菌数测定。

1.3.7 固体和液体菌剂室内接种结瘤效果验证。

该试验对固体和液体菌剂分别进行室内接种紫花苜蓿的结瘤测试，接种的紫花苜蓿种子分消毒和不消毒2种处理，消毒方法为：浓硫酸浸泡5 min，无菌水冲洗5～7次，5%次氯酸钠处理2 min，无菌水冲洗5～7次后备用。处理或不处理的种子分别用液体菌剂和固体粉剂拌种，对照不接种菌剂然后植入经Fahraeus无氮营养液[11]配制的固体琼脂斜面上。接种后定期观察植物生长情况，适量添加无氮营养液，保证植物生长水分所需。

将消毒过的种子取出，接种过液体菌剂与固体粉剂的各取20粒，放入100 mL无菌水内，摇匀10 min，梯度稀释，涂布平板，测定液体中的菌活数，计算种子平均带菌量。培养40 d后，统计植物结瘤情况。

1.3.8 菌剂田间接种施用效果研究。

试验组分别施加固体粉剂与液体菌剂，对照组不接种菌剂，每个处理5个重复，随机排列，共15个小区，每小区面积为3 m×5 m，小区间隔离带宽1 m。播种前，将已经制备好的菌剂与中苜一号紫花苜蓿种子拌匀，液体和固体菌剂拌种量分别为1 500 mL/hm2和1 500 g/hm2，条播，行间距30 cm，播种量为11.25 kg/hm2，生长季末，每处理分别随机选取50株单株植物统计结瘤数，计算结瘤率。将每个小区按照五点取样方法，每个点取1 m2，測量植株鲜重。

1.4 数据分析 采用SPSS 13.0软件对试验数据进行单因素方差分析，并利用Tukey检验进行多重比较，确定各因子内部不同水平平均值之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 中华草木犀根瘤菌（Sinorhizobia meliloti 848-1）生长曲线

菌株接种于YMA液体培养基中培养60 h后，测定培养液OD值，获得菌株生长曲线如图1。从菌株848-1的生长曲线可以看出，培养20 h后进入对数生长期，大约40 h后进入稳定期，该研究在对数期前即40 h时收集菌体。

2.2 固体菌剂载体类型的选择

确定了不同配比载体的饱和持水量后，将菌剂含水量调节到10%，经过每隔20 d的为期80 d的活菌数测定，发现单一载体高岭土保存效果最好，80 d后，活菌数为1.2×107 CFU/g，如图2所示，与其他配比载体相比，差异极显著（P<0.01）。

2.3 固体菌剂含水量研究

对保存80 d在不同含水量条件下的固体菌剂5个时期的菌活数进行测定，活菌数变化趋势如图3，在3个不同梯度含水量的条件下，可发现10%含水量的菌剂菌活数较好，保存80 d后，活菌数为6.95×107 CFU/g，经过统计分析，差异显著（P<0.05）。

2.4 固体菌剂保存温度的确定 对保存80 d在常温和4 ℃保存下的固体菌剂5个时期活菌数测定，从图4可以看出，4 ℃保存较常温保存菌活数差异显著（P<0.05），表明4 ℃的保存效果较常温（25 ℃）好，80 d后菌剂活菌数为1.07×108 CFU/g，符合国家对根瘤菌菌剂的要求，可以延长菌剂保质期。

2.5 固体菌剂添加剂的选择

在固体菌剂中加入添加剂后可明显延长菌剂保存时间，固体菌剂加入不同的添加剂后，每20 d抽样检测一次，变化趋势如图5，发现添加剂对菌剂保存效果极显著（P<0.01），保存80 d活菌数仍很高，均保持在108数量级上，最高可达9.07×108CFU/g。而無添加剂的菌剂，60 d后活菌数开始迅速下降，80 d后降至1.01×107 CFU/g。但是，2种添加剂的差异不显著（P>0.05），考虑到商业生产成本，海藻糖价格高于PVP，可用PVP来代替海藻糖用于生产，综上可以初步确定选择1%的PVP作为固体菌剂的保护剂。

2.6 液体菌剂添加剂的确定

4种添加剂分别设置了3种浓度，每20 d抽样检测一次，80 d后，根据各个时段测定的活菌数，计算各个时段活菌数变化的标准差，正交试验结果如表1。由表1可知，液体菌剂中，同时添加1.0%海藻糖、5.0%PVP、10.0%蔗糖保存效果最好，80 d后活菌数仍保持在108数量级上，符合国家根瘤菌菌剂要求。

2.7 2种菌剂室内结瘤效果验证

种子带菌数测定结果（表2）表明，液体菌剂处理的种子带菌数明显高于固体菌剂。接种40 d后，统计紫花苜蓿植株的结瘤情况，结果如表3所示。接种种子的2种处理表明，种子经过消毒处理，平均单株结瘤量提高72.4%;施用液体菌剂与固体菌剂相比，紫花苜蓿单株结瘤量提高25.7%。经过统计分析，差异显著（P<0.05）。

2.8 固体和液体菌剂田间施用效果的测试 生长季末，随机取样并统计单株结瘤数和植物鲜重。由表4可知，施用根瘤菌菌剂对紫花苜蓿的结瘤数和植株的鲜重影响显著（P<0.05）;与对照组相比，施加液体菌剂和固体菌剂后，紫花苜蓿植物分别增产21.9%和24.2%，结瘤率分别提高66.7%和67.1%。说明施加根瘤菌菌剂可提高苜蓿产量，但施加液体菌剂与固体菌剂间差异不明显（P>0.05）。

3 讨论

3.1 菌剂的制备和保存

制备高质量的固体菌剂首要的是选择合适的载体。高岭土是非金属矿产资源，储量丰富，用途广泛，将其用于农业生产不会产生任何毒副作用。玉米秸秆作为农业生态系统中一种十分宝贵的生物质能资源，价廉、易得且营养丰富，可作为一种新型环保载体材料。该研究对比了高岭土和玉米秸秆制成的各种配比的复合载体，发现单一载体高岭土效果最好，80 d后活菌数仍有1.2×107 CFU/g，说明高岭土对菌体有良好的保护作用，可延长菌剂保存时间，这与田晓丽等[12]在生防菌Fo47菌株和洪永聪[13]在生防菌TL2菌株的菌剂研制结果一致。而含有玉米秸秆成分的载体均较差，含有玉米秸秆成分的菌剂杂菌污染严重，可能是玉米秸秆营养丰富和可利用的化学成分多导致。

适当的湿度和保藏温度对根瘤菌的保藏也很重要。通过对固体菌剂不同含水量（5%、10%、15%）和保存温度（25和4 ℃）的研究发现，10%含水量的固体菌剂并在4 ℃保藏下保存效果最好，且4 ℃的保存条件不难实现，可被推广。

相关研究证明，在菌剂内添加PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、海藻糖、丙三醇、麦芽糖、山梨糖、蔗糖等组分作为保护剂，能够提高菌活数，延长菌剂保质期[14-16]。在该研究中，固体菌剂中添加1.0%的PVP，液体菌剂中同时添加1.0%海藻糖、5.0%PVP和10.0%蔗糖，为最佳比例。

3.2 2种菌剂室内结瘤效果和田间施用效果验证

根瘤菌与植物共生固氮受当地环境的影响，如环境温度、土壤营养、土壤湿度以及酸碱度等[17]，因此研究适合特定环境的根瘤菌菌剂十分重要。高振生等[18]在黄河三角洲接种紫花苜蓿根瘤菌，紫花苜蓿产量提高50%～93%，结瘤率提高70.97%～73.39%。宁国赞等[19]在辽宁、黑龙江、云南、江西及内蒙等多个试验点给紫花苜蓿接种根瘤菌，平均增产37.8%。喻文虎等[20]在甘肃省高寒阴湿地区种植紫花苜蓿，接种根瘤菌，增产27%。

河北省是种植紫花苜蓿的大省，但缺乏紫花苜蓿根瘤菌菌剂的应用研究。曾昭海等[21]在河北吴桥种植紫花苜蓿并接种3种高效根瘤菌，紫花苜蓿产量分别增加11.9%、10.2%和13.7%，经分析是当地土著根瘤菌占瘤率偏高所致。该研究以在河北地区筛选的一株高效菌株为菌剂生产菌株，田间试验在河北张家口进行，尽管当地环境寒冷、干旱，接种高效根瘤菌液体菌剂和固体菌剂后，紫花苜蓿产量仍分别提高21.9%和24.2%，结瘤率分别提高66.7%和67.1%。说明该研究的菌剂有实际应用效果，试验菌株相对于土著根瘤菌有竞争优势。而施用液体菌剂和固体菌剂间差异不显著，与室内结瘤试验验证结果不一致，可能是由于实验小区土壤的不均一化导致。

4 小结

此次研究以在河北地区筛选的一株高效专利菌株为菌剂生产菌株，进行了菌剂的制备和保存方法，所得固体菌剂和液体菌剂在保存80 d后，活菌数均保持在108数量级上，符合国家根瘤菌菌剂标准。同时田间试验表明，施用根瘤菌菌剂可明显提高紫花苜蓿产量。该研究可为紫花苜蓿根瘤菌菌剂在河北地区的推广提供技术支持。

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