红景天甙通过抑制PI3K/AKT通路促进人胃癌AGS细胞凋亡①

游 莉 黄 薇 池祥波 陈耀凯 欧阳净 王 丽 荣 黎

(西南大学医院，重庆 400715)

作为发病率最高的消化道恶性肿瘤，胃癌的药物疗效不容乐观[1,2]。中药在肿瘤防治中具有诸多优势。红景天甙为红景天提取物，在白血病、乳腺癌等肿瘤中功效显著，极具开发前景，课题组前期功能实验证明其能抑制胃癌细胞增殖，促进凋亡[3-5]。PI3K/AkT是调控细胞凋亡的重要通路，与肿瘤发生发展密切相关，以关键分子为靶点的肿瘤药物开发逐渐深入[6，7]。本研究以PI3K/AKT信号为靶点，研究其在红景天甙促进胃癌细胞凋亡中的作用，为深入探究红景天甙在胃癌中的治疗效果及相关机制提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人胃癌细胞株AGS由重庆医科大学基础医学院馈赠。

1.1.2试剂 红景天苷(南京格尔狄生物科技有限公司)，1640培养基(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国Gibco公司),IGF-1(美国Sigma Aldrich公司)，CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)，Hoechst33342、AV/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京碧云天生物公司)，Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体(上海abwaystechnology公司)

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 AGS细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基，取对数生长期细胞用于实验。不含红景天甙的1640培养基作为对照组，红景天甙处理的胃癌细胞作为实验组，10 μmol/L IGF-1预处理30 min的实验组作为干预组。

1.2.2CCK-8法检测红景天甙对AGS细胞增殖的影响 80%～90%生长密度且状态良好的对数生长期胃癌细胞以5×104个/孔接种于96孔板，加入经PBS溶解的不同浓度的红景天甙，每组设 3个复孔。37℃培养48 h，1 700 r/min离心，弃上清，加入10 μl CCK-8试剂避光孵育1 h，酶标仪进行双波长(490 nm 和630 nm)检测 OD值，计算IC50并绘图。抑制率(%)=(1-OD实验组/OD对照组) ×100%。

1.2.3Hoechst33342染色观察红景天甙对细胞凋亡形态学的影响 1×105个/孔细胞接种于含有无菌玻片的24孔板培养24 h，不同浓度红景天甙处理48 h，PBS洗3次，500 μl 4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3次，PBS 1∶20稀释DAPI，每孔200 μl 稀释液常温染色10 min，PBS洗3次，封片，正置荧光显微镜观察。

1.2.4AV/PI流式细胞术检测红景天甙对AGS细胞凋亡的影响 1×106个/孔接种于6孔板培养24 h，加入10 μmol/L IGF-1及不同浓度红景天甙处理。48 h后收集细胞，800 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤，悬浮于缓冲液中，AV/PI室温暗处染色15 min。流式细胞仪分析样品。

1.2.5免疫印迹观察红景天甙对凋亡蛋白及PI3K/AKT通路蛋白的影响 在积层胶聚合时收集处理好的AGS细胞,预冷PBS洗涤1次，100 μl预冷Western细胞裂解液重悬细胞后冰浴裂解 30 min,4℃ 12 000 r/min离心10 min，收集上清。BSA作为蛋白标准品,Lowry法测定样品蛋白浓度以确定上样量。样品经SDS-PAGE电泳后,转膜、封闭,分别加入一抗和二抗,DAB显色。室温轻摇5 min 后观察蛋白条带,待显色清晰转入PBS漂洗,ECL化学发光照相。

2 结果

2.1红景天甙抑制AGS细胞增殖 随红景天甙浓度增加，人胃癌AGS细胞增殖活性受到显著抑制(图1)，且呈浓度依赖性，IC50值为36.54 μmol/L，40 μmol/L作用48 h后抑制为45.27%，最接近IC50，故以40 μmol/L作用48 h进行相关检测。

2.2红景天甙促进AGS细胞核固缩 Hoechst 33342染色结果显示，红景天甙处理细胞后出现细胞核染色质固缩增加，表明红景天甙促进细胞凋亡(图2)。

2.3红景天甙促进AGS细胞凋亡 流式细胞分析结果表明与对照组相比，红景天甙处理组细胞凋亡率显著增加(图3)，PI3K/AKT激动剂IGF-1处理后，红景天甙的促凋亡效应受到明显抑制(图4)，凋亡细胞数明显减少，凋亡率下降，表明红景天甙可通过抑制PI3K/AKT通路促进AGS细胞凋亡。

2.4免疫印迹检测红景天甙对凋亡蛋白及PI3K/AKT蛋白表达的影响 与对照组相比，红景天甙抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，明显促进促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9和cleaved-PARP表达(图5)。

图1 CCK8法检测红景天甙对胃癌细胞增殖的影响Fig.1 Effect of salidroside on proliferation of gastric cancer cells by CCK8 assay

图2 Hoechst染色观察红景天甙对AGS细胞凋亡形态学影响Fig.2 Effects of salidroside on apoptotic morphology of AGS cells with Hoechst staining

图3 流式细胞检测红景天甙对胃癌细胞凋亡的影响Fig.3 Flow cytometry was used to detect effects of salidroside on apoptosis of gastric cancer cells

图4 流式细胞检测IGF-1干预处理对红景天甙促凋亡作用的影响Fig.4 Flow cytometry was used to detect effect of IGF-1 on salidroside-induced apoptosis

图5 Western blot检测红景天甙对凋亡相关蛋白表达的影响Fig.5 Effect of salidroside on apoptosis-related proteins was detected by Western blot

红景天甙显著抑制PI3K和AKT活化，磷酸化PI3K蛋白和磷酸化AKT蛋白表达下调(图6)。PI3K/AKT激动剂IGF-1干预后，红景天甙促凋亡效应明显减弱(图7)。

图6 Western blot检测红景天甙对PI3K/AKT通路蛋白的影响Fig.6 Influence of salidroside on PI3K/AKT pathway proteins was detected by Western blot

图7 Western blot检测IGF-1干预对红景天甙促凋亡作用的影响Fig.7 Western blot was used to detect effect of IGF-1 on salidroside-induced apoptosis

3 讨论

胃癌全球年发病率位居恶性肿瘤第四，年病死率位居第二，高居我国消化道肿瘤发病率首位[1,2]。胃癌早期症状隐匿，确诊时多为进展期，仅靠手术联合放化疗通常难以治愈，尽管内镜下早癌筛查近年已广泛开展，但限于国民经济、文化、健康意识等因素，现阶段早癌筛查仍未普及，以VEGF、EGF为主要靶点的分子靶向治疗有待临床验证，目前胃癌的治疗尤其是药物治疗效果不容乐观[8,9]。红景天甙(salidroside)是一种天然化合药物，在乳腺癌、膀胱癌和结肠癌中发挥抗肿瘤效应[10-14]。研究表明，红景天甙通过氧化应激和MAPK通路抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖和迁徙，诱导凋亡，可抑制人结肠癌HT-29细胞生长，并通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导自噬和凋亡[15,16]。对多株膀胱癌细胞的研究表明，红景天甙通过抑制mTOR通路并诱导自噬进而抑制细胞生长[17]。但红景天甙在胃癌中的治疗作用鲜有报道[18]。因此本课题组将红景天甙应用于胃癌细胞，发现红景天甙对不同分化程度的胃癌细胞均具有抑制增殖和迁徙、促进凋亡等作用[5]。

PI3K/AKT是调控细胞凋亡的重要信号通路，通过多种途径影响下游效应分子活化，发挥抑制凋亡和促进增殖的作用,与人类诸多肿瘤密切相关[6，7]。研究证实PI3K调控激活AKT，直接抑制Bad、Caspase-9、GSK-3等活性，抑制细胞凋亡发生[19]。以PI3K/AKT通路中的关键分子为治疗靶点的肿瘤药物开发正逐步深入。

本研究聚焦于PI3K/AKT通路，探讨红景天甙促进胃癌细胞凋亡的相关作用机制。通过Hoechst染色、流式细胞术和Western blot从多角度提示红景天甙显著诱导胃癌AGS细胞凋亡，表明诱导凋亡是红景天甙抑制胃癌细胞生长的重要方式。免疫印迹发现红景天甙抑制磷酸化PI3K和磷酸化AKT蛋白的表达，提示红景天甙抑制PI3K/AKT通路。进一步利用PI3K/AKT激动剂IGF-1预处理AGS细胞后，通过流式细胞和Western blot分析发现激活PI3K/AKT通路后，红景天甙诱导凋亡的作用明显减弱，揭示红景天甙可通过抑制PI3K/AKT通路促进胃癌AGS细胞凋亡。

综上所述，红景天甙作为植物类中药在肿瘤防治中具有诸多优势，未来我们将进一步利用细胞、动物模型结合基因组学、蛋白组学、生物信息学等手段对红景天甙的抗癌作用进行深入研究，为阐明中药红景天甙防治肿瘤的机制提供依据。