CO2气腹对裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI表达的影响

黄金智，洪龙年，陈惠娟，谭晓瑜，张玲莉* （.广东医科大学附属医院妇产科，广东湛江5400；.广东医科大学，广东湛江 5403）

腹腔镜手术因其创伤小、康复快、住院时间短等优点，目前已成为妇科最常用的微创手术方式，越来越多地被用于妇科良恶性肿瘤的诊断与治疗，但是对于腹腔镜应用过程中CO2气腹是否会促进恶性肿瘤的生长与转移目前仍存在一些争议。前期研究发现，经CO2气腹处理的裸鼠，其卵巢癌移植瘤的分布面积更广、数量更多、总质量更大，且随着CO2气腹处理时间的延长该效应更明显[1]。尿激酶型纤溶酶原激活(uPA)系统在恶性肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用。本文采用免疫组化、real-time PCR和western blotting检测裸鼠卵巢癌移植瘤组织中uPA、uPAR、PAI mRNA和蛋白质的表达水平，观察CO2气腹对这3个基因表达的影响，以探讨CO2气腹影响卵巢癌生长转移的可能机制。

1 材料和方法

1.1 裸鼠卵巢癌移植瘤组织切片及新鲜组织

裸鼠卵巢癌移植瘤组织切片来自本实验室前期收集的裸鼠卵巢癌移植瘤组织蜡块，切片制备；新鲜组织为前期收集，经液氮速冻30 min，以锡箔纸包裹冻存于－86 ℃超低温冰箱的组织。卵巢癌移植瘤模型造模过程简述如下：7～8周龄，雌性Balb/c裸鼠予腹腔注射0.5 mL的2×106卵巢癌细胞株SKOV3细胞悬液，造模后裸鼠随机分为对照组、开腹组、CO2气腹0.5 h组、CO2气腹1 h组，每组10只。对照组裸鼠仅接受麻醉处理；开腹组裸鼠麻醉后，沿腹中线开2 cm切口，30 min后关闭腹腔；CO2气腹0.5 h和CO2气腹1 h组：裸鼠麻醉后，分别给予腹腔CO2通气30、60 min(将2根钝头注射针分别从裸鼠左右下腹插入腹腔，其中一根注射器连接CO2钢瓶，输入气体压力为5 mmHg，气流量为0.1 L/min，另一根用于排出CO2，通气结束后拔除注射针，以输液贴覆盖针孔)。4组裸鼠均于造模后12周处死并取瘤体组织。

1.2 免疫组化

按照二步法免疫组化检测试剂盒(PV-6002，中杉金桥)的操作说明进行，抗原修复采用高压修复法，即将脱蜡水化后的组织切片放入煮沸的柠檬酸缓冲液中，高压锅加热喷气2 min后停止，自然冷却至室温； 一抗uPA抗体(sc-14019)、uPAR抗体(sc-13522)和PAI-1抗体(sc-5297)的稀释度均为1:50，4 ℃孵育过夜；以DAB显色试剂盒(ZLI-9017，中杉金桥)进行显色，苏木素复染2 min，剃度酒精依次脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察；以PBS代替一抗作为阴性对照。免疫组化结果判断：阳性蛋白染色因表达强度不同可在镜下呈现未着色(与背景相近)、浅黄色(略高于背景)、棕黄色(中度着色)和棕褐色(深度着色)，分别计为0、1、2、3分；其中1～3分均为阳性细胞，随机取5个高倍视野，计算阳性细胞比例，阳性细胞比例<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计为0、1、2、3、4分；两种计分相加，总分为0～1、2～3、4～5、6～7分分别表示阴性、弱阳性(-/+)、中等阳性(++)和强阳性(+++)。

1.3 总RNA提取

以液氮研磨方式磨碎组织，然后按照RNAiso Plus试剂盒(D9108A，TAKARA)的操作说明提取总RNA，以1%琼脂糖电泳判断RNA完整性，并用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度(OD260/OD280为1.8～2.0)。

1.4 实时荧光定量PCR(real-time PCR)

每个样本取1 μg提取的总RNA，采用Prime®Script RT reagent kit with gDNA Eraser (RR047A，TAKARA)试剂盒进行逆转录：37 ℃ 15 min→85 ℃5 s→4 ℃ 1 h。采用实时荧光定量PCR检测试剂盒SYBR® Premix Ex Taq™II(RR820A，TAKARA)和LightCycler®480 System Real Time PCR扩增仪进行扩增，扩增程序为：95 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(40个循环)→95 ℃ 5 s→60 ℃ 1 min→50 ℃ 30 s→4 ℃ 1 h。以2-ΔΔCt计算目的基因mRNA的相对表达量。扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下：

1.5 总蛋白提取

每个样本取100 mg组织，剪碎放入预冷的玻璃匀浆器，加入500 μL细胞裂解液RIPA(含1 mmol/L的PMSF)，冰上匀浆，将匀浆液吸入离心管，4 ℃，10 000 r/min离心10 min，然后将上清转移至干净的离心管，用Bradford蛋白定量试剂(BB-3411，贝博生物)测试蛋白浓度，提取的总蛋白分装，保存于－80℃冰箱备用。

1.6 western blotting

每组取等量混合蛋白样本70 μg，用十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白条带，转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉溶液封闭膜，分别孵育一抗uPA、uPAR和PAI-1抗体和内参GAPDH抗体(sc-47724)，二抗(辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠二抗A0216购自碧云天公司)，采用ECL化学发光法进行检测，凝胶成像系统采集蛋白条带发光图像信息，经灰度扫描分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据以±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

由图1所示，uPA和PAI-1蛋白的阳性表达主要定位于卵巢癌细胞质中，uPAR蛋白的阳性表达主要定位于卵巢癌细胞膜中。与对照组及开腹组比较，CO2气腹0.5 h和CO2气腹1 h组可以增加卵巢癌移植瘤组织中的uPA、uPAR和PAI的阳性表达水平，且CO2气腹1 h的表达水平更高，但组间比较差异均没有统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1 免疫组化图(200×)

图2 uPA、 uPA 和PAI在4组卵巢癌组织中表达强度的比较

2.2 Real-time PCR结果

由图3所示，与对照组和开腹组相比，CO2气腹0.5 h和CO2气腹1 h组均能明显促进卵巢癌移植瘤组织中的uPA、uPAR和PAI的mRNA表达水平(P<0.05)。CO2气腹1 h组的uPA、uPAR和PAI mRNA表达水平虽略高于CO2气腹0.5 h组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 Western blotting结果

与对照组和开腹组相比，CO2气腹0.5 h和CO2气腹1 h组均能明显促进卵巢癌移植瘤组织中的uPA、uPAR和PAI的蛋白表达(P<0.05)。uPA在CO2气腹1 h组的蛋白表达水平略低于CO2气腹0.5 h组，uPAR和PAI则高于CO2气腹0.5 h组，但两组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图4、5。

图3 CO2气腹对裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI-1 mRNA表达水平的影响

图4 CO2气腹对裸鼠卵巢癌移植瘤中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达水平的影响

图5 不同组间uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达水平的比较

3 讨论、论

近20年来，腹腔镜手术因其手术损伤小出血量少、术中视野开阔清晰、患者恢复快、痛苦少、住院时间短等优点，越来越多地被用于妇科良恶性肿瘤的诊治，如子宫肌瘤、早期子宫内膜癌、宫颈癌、早期卵巢癌等，但是有研究表明，腹腔镜手术用于恶性肿瘤诊治时，会增加肿瘤转移的风险，与开腹手术组相比，腹腔镜手术组早期宫颈癌患者的无病生存率和总生存率均低，且研究认为这与腹腔镜手术过程中使用的CO2气腹相关[2]。在前期研究中，我们用卵巢癌移植瘤裸鼠模拟CO2气腹，发现同对照组与开腹组相比，CO2气腹处理组裸鼠的肿瘤数量更多、肿瘤体积更大、分布部位更广[1]，但其机制并不清楚。研究显示CO2气腹可能通过对腹腔产生的机械压力，局部干冷、缺氧的环境导致腹腔pH降低，进而抑制腹腔巨噬细胞功能，下调免疫功能，对肿瘤细胞的杀伤力大为减弱,从而导致肿瘤细胞的粘附、增殖，而缺氧环境又能诱导肿瘤细胞内多种细胞因子的表达，从而增加肿瘤细胞的增殖、侵袭能力[3]。

uPA是缺氧诱导产生的一种细胞因子，它是一种丝氨酸蛋白水解酶，主要与细胞分化、迁移、组织重建、细胞周围基质降解有关，通过与uPAR 结合发挥作用。研究发现多种恶性肿瘤细胞，包括卵巢癌细胞，可以分泌uPA。美国一项研究发现乳腺癌uPA水平增高与患者预后相关，因而提出uPA可以作为危险评估因子和治疗靶点[4]。uPA与uPAR结合后转化为有活性的uPA-uPAR，从而使纤溶酶原(plasminogen)激活成纤溶酶(plasmin)，可激活前基质金属蛋白酶(proMMP)，从而激活 proMMP 引起胶原的降解；纤溶酶还可以通过增加血管内皮生长因子(VEGF)的活性刺激血管的生成。另外，uPA/uPAR不仅能增强蛋白溶解，调节细胞黏附，还能促进体内肿瘤细胞增殖、转移和肿瘤血管生成[5]。

PAI属丝氨酸抑制因子家族，目前已知有PAI-1、PAI-2、蛋白酶nexin、蛋白酶C抑制剂(PCI)4种。PAI-1是有效的特异性uPA抑制剂，在生理条件下对uPA有极高的亲和力。PAI-1不仅能结合可溶形式的uPA，还可以结合已与受体结合形式的uPA，从而抑制纤溶酶原的激活。uPA-PAI-1复合物的水平增高的乳腺癌患者预后不良，并影响患者的存活率[6]。基质中uPA/PAI-1蛋白的协同表达则预示着乳腺癌患者较差的结局。uPA、uPAR、PAI常以一个相互作用的调控系统维持了纤溶酶系统的平衡状态，维持蛋白质的稳态，参与诸如细胞增殖、粘附、移动等活动。

因此，在本研究中我们采用了免疫组化、realtime PCR和western blotting检测了裸鼠移植瘤组织中的uPA、uPAR、PAI基因的表达情况，发现无论是mRNA水平还是蛋白水平，CO2气腹处理组均高于开腹组和对照组，提示CO2气腹处理有可能通过促进uPA、uPAR、PAI的表达促进卵巢癌的生长与转移。

有研究证实在缺氧环境中uPA的表达会上调[7]。而CO2气腹所致的高气腹压会导致腹腔暂时缺血、缺氧；同时CO2气体具有组织低溶性，血液高溶性的特点，易致血液pH值下降，造成高碳酸血症甚至酸中毒，在酸性环境中，腹腔局部血供减慢，进一步加重局部缺血缺氧，这可能就是CO2气腹引起该轴表达上调的原因。uPA、PAI的表达与缺氧诱导因子1(HIF-1)高度相关，HIF-1是缺氧刺激激活的一种重要的转录因子[8-9]。这可能也是本研究中CO2气腹处理组裸鼠移植瘤中uPA、uPAR、PAI表达升高的原因，但是其具体的分子机制还有待进一步的研究。