不同方法破除黄花苜蓿新品系种子硬实的效果研究

崔乐乐， 刘佳月， 王照兰, 吕汝婕,3， 杜建材

(1.中国农业科学院草原研究所， 内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古大学生态与环境学院/蒙古高原生态学与资源利用教育部重点实验室/省部共建草地生态学国家重点实验室培育基地, 呼和浩特 010021；3.内蒙古师范大学， 呼和浩特 010022)

有关干旱、半干旱地区植物种子萌发的研究在一年生植物上研究较多[1-2]，它们的萌发类型与多年生植物有很大的不同。由外因(物质的或机械的)和内因(形态学或生理学)共同导致许多多年生植物种子的硬实[3]。而种皮不透水是多年生植物种共有的特性，例如豆科植物。豆科植物广泛存在硬实现象[4-8]，可使种子在不同的时间相继萌发，物种得以保存[9]。

硬实现象是植物在进化过程中获得的适应不良环境的能力，可使种子在较长时期内保持活力，尤其是在气候多变的地区，能保证种子在最佳的环境条件下得以萌发[10]，对植物种质资源的保存和传播极为有利[11]。由于栖息地、种皮的渗透性、种子生理特性、生活史和对环境的反应有所不同，占据相似生境条件的植物种往往表现出不同的硬实和萌发特性[12-13]。

在野生或自然条件下，环境的作用能改变植物硬实种子的种皮透性，使同一植物种的不同个体先后获得发芽能力，其种子可在不同年份或同一年份的不同时间、当水热条件适宜时陆续出苗，保证了物种的延续[14]。但是，在农业生产中，硬实严重影响田间出苗率[15]，导致出苗不整齐、发芽滞后等现象，难以进行田间建植。因此，探索破除种子硬实的方法对农业生产实践具有重要的指导意义。

黄花苜蓿(MedicagofalcataL.)是一种多年生豆科牧草，是重要的饲料作物。其生态适应性强，分布范围广，草质柔软，营养丰富，是一种全价饲料，其蛋白质、能量、矿物质及维生素的含量能够满足多种家畜生产的营养需要[16-17]。在我国，野生黄花苜蓿广泛分布在东北、华北和西北，包括呼伦贝尔盟鄂温克旗境内，锡林郭勒盟锡林浩特周边地区，赤峰克旗，新疆阿尔泰地区以及伊犁地区的新源县、尼勒克县、昭苏县、巩留县、察布查尔县等干旱半干旱地区等。我国西藏地区也有黄花苜蓿的分布。其抗寒、抗旱性强，在畜牧业生产中起着非常重要的作用。但是，黄花苜蓿和很多豆科植物一样存在硬实率高的问题，严重影响其推广应用。因此，破除黄花苜蓿硬实的研究具有重要意义。

采用多种方法系统研究打破黄花苜蓿种子硬实的报道较少。伊风艳等[19]采用6种方法对野生黄花苜蓿种子硬实进行了研究。本研究共采用13种方法对黄花苜蓿种子进行处理，旨在筛选破除黄花苜蓿种子硬实最适宜的技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试材料为中国农业科学草原研究所培育的黄花苜蓿新品系种子。

1.2 试验方法

1.2.1发芽试验

将采用不同方法进行硬实处理后的种子放在铺有2层滤纸的培养皿中进行室内发芽，每个处理3次重复，每个重复100粒种子，以蒸馏水处理的种子作为对照，发芽温度(22±2)℃，每天记录种子的发芽数。根据国际种子检验规程ISTA[20]，第10天统计正常幼苗数及硬实种子数，并计算发芽率、硬实率。

发芽率(%)=(正常幼苗数/供试种子总数)×100%；

硬实率(%)=(未发芽的种子数/供试种子总数)×100%。

1.2.2破除种子硬实处理

1) 低温处理：分别将种子放进4 ℃和-18 ℃冰箱内处理7 d。

2) 液氮处理：用液氮处理种子3、10、15 min。

3) 热水处理：分别用50、75、100 ℃ 热水处理种子至水自然冷却，将种子取出备用。

4) 高温干燥处理：将种子放在30、50、70 ℃恒温干燥箱中分别处理0.5、1、2、3 h。

5) 砂纸打磨处理：用80目的砂纸打磨种子直到种子表面失去光泽为止。

6) 激素(赤霉素，GA)处理：分别用200、400、600 mg·L-1的GA对种子进行处理 6、24、36、48 h。

7) 盐酸(HCl)处理：分别用10% HCl和浓HCl处理种子，在处理的10、20、30、40、60、80、120 min 取出备用。

8) 硫酸(H2SO4)处理：分别用10%、20%、40%、70%、98% 的H2SO4对种子进行处理，每个浓度设置5、10、15、20、25、30、40、60 min等8个时间梯度。

9) NaOH处理：用10%、40% 的NaOH分别浸泡种子10、20、40、60、80、120 min。

10) KMnO4处理：用0.3%、0.9%的KMnO4溶液分别浸泡种子2、4 h。

11) KNO3处理：采用0.1%、0.2%、0.3%、0.5%共4个不同浓度的KNO3浸湿发芽床，进行发芽试验。

12) NaCl处理：分别用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5% NaCl溶液浸湿发芽床，进行发芽试验。

13) H2O2处理：采用30% H2O2对种子分别处理10、20、40、60、80、120 min。

1.2.3数据统计分析

采用Excel软件和SAS 9.2软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 低温处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

本研究选用的黄花苜蓿种子自然发芽率只有29%，硬实率高达71%。低温处理对黄花苜蓿的发芽率、硬实率均有影响(图1)。4 ℃低温处理能降低种子的硬实率，但差异未达到显著水平。-18 ℃处理能使硬实率降低到52%，显著低于对照(p<0.05)；发芽率提高到47%，显著高于对照(p<0.05)。

图1 低温处理7 d破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.2 液氮处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

3 min、10 min、15 min不同时间梯度的液氮处理之间对破除黄花苜蓿种子硬实的效果差异不显著(p>0.05)，但三者均能显著提高种子的发芽率(p<0.05)，最高可达64%，比对照增长了35%，硬实率可降至33%(表1)。但发芽后的幼苗，在生长过程中的死亡率增加。结果表明，液氮在提高种子发芽率的同时也对种子造成了很大的伤害。

表1 液氮处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

处理时间/min发芽率/%死苗率/%死种率/%硬实率/%液氮364a22333b1062a24335b1564a26036bck29b0071a

注：同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(p<0.05)。下同。

2.3 热水处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

黄花苜蓿的发芽率随着浸种热水的温度升高而升高(图2)。50 ℃热水处理种子的发芽率、硬实率与对照差异不显著(p>0.05)。75 ℃热水浸种可显著提高其种子发芽率，达47%，但硬实率下降不显著。100 ℃热水处理发芽率升高到62%，硬实率下降至38%，比对照降低了33%，二者差异显著(p<0.05)。

注：不同小写字母代表不同温度之间差异显著(p<0.05)。

2.4 高温干燥处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

高温干燥处理对种子发芽率和硬实率的影响如图3所示。其中，30 ℃和50 ℃的各个时间梯度处理与对照相比硬实率破除效果均不显著(p>0.05)。70 ℃高温干燥在各个时间梯度处理下硬实率均显著降低，其中，以1 h处理下降幅度最大，降至45.1%，与未处理的对照相比(71%)，降低了25.9%。

注：不同小写字母代表同一温度不同处理时间之间差异显著(p<0.05)。下同。

图6 H2SO4处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.5 砂纸打磨处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

如表2所示，适度的砂纸打磨处理能完全破除供试黄花苜蓿品系的种子硬实，硬实率降为0，发芽率升高到98%，与对照相比提高了69%。只有2%的种子发生死种现象。

表2 砂纸打磨处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

处理发芽率/%死种率/%硬实率/%ck29b071a砂磨98a20b

2.6 GA处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

GA处理对黄花苜蓿种子发芽率的影响如图4所示。200 mg·L-1GA处理6 h，发芽率达41%，提高了12%；硬实率降低至59%，降低了12%；24、36、48 h的处理，效果不显著。

400 mg·L-1GA处理24 h，发芽率达41%，提高了12%；硬实率降低至56.7%，降低了14.3%；其它时间的处理，效果均不佳。

600 mg·L-1GA处理6 h能使发芽率提高到46%，比对照提高了17%；硬实率降低至54%，降低了17%；其它时间的处理，效果均不显著。

图4 GA处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.7 HCl处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2个浓度的HCl处理不同时间，对供试黄花苜蓿种子破除硬实率的效果均不理想。多数处理没有显著影响(图5)；10% HCl 处理40 min、60 min和80 min，发芽率提升虽然均达到显著水平(p<0.05)，但其处理后的种子硬实率依然较高，分别为66%、65%、65%。

图5 HCl处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.8 H2SO4处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

不同浓度梯度和时间梯度的H2SO4浸种对黄花苜蓿的发芽率和硬实率有不同的影响(图6)。10%、20%、40%、70% H2SO4在各个时间梯度处理下，破除黄花苜蓿种子硬实的效果均不理想。98% H2SO4浸种，在各个时间处理梯度上对破除黄花苜蓿种子硬实均有显著效果(p<0.05)。其中，处理5 min时，发芽率可从29%提高至48.66%；处理10 min、15 min和20 min 时，发芽率分别为75%、70%和73%，三者之间差异不显著；处理25 min时，发芽率可达84%，处理40 min时，发芽率达88%，处理60 min时，发芽率达到91%，硬实率分别下降到16%、10%和8%，但三者之间差异不显著。

2.9 NaOH处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

10% NaOH处理20 min 能使黄花苜蓿种子硬实率从71%降低至58%，二者差异显著(p<0.05)。该浓度下的其它时间处理效果与对照相比均不显著(图7)。

40% NaOH处理10 min，能使供试黄花苜蓿种子发芽率从29%提高到42%，硬实率降低至58%，和10% NaOH处理20 min效果相同。该浓度下的其它时间处理效果均不明显(图7)。

图7 NaOH处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.10 KMnO4处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

0.3%和0.9%的KMnO4处理2 h对破除黄花苜蓿种子硬实均无显著效果；处理4 h的硬实率分别为62%和60%，硬实率下降幅度均达到显著水平(p<0.05)(图8)。

图8 KMnO4处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.11 KNO3处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

不同浓度的KNO3处理对破除黄花苜蓿种子硬实均无显著效果(p>0.05)(图9)。

图9 KNO3处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.12 NaCl处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

随着NaCl浓度的升高发芽率呈先增加后减少的趋势(图10)。0.2%的NaCl处理能显著提高供试黄花苜蓿种子的发芽率(40.7%)，降低硬实率(59.3%)(p<0.05)；0.4%、0.6% NaCl处理下的发芽率与对照相比均无显著差别(p>0.05)；当NaCl处理浓度升高至0.8% 以上时，不仅不能破除硬实，反而抑制种子萌发。

图10 NaCl处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

2.13 H2O2处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

30% H2O2处理20 min能显著降低硬实率、提高发芽率(图11)。当处理时间延长至40 min时，硬实率反而升高至79%，发芽率降低到21%。60 min、80 min、120 min处理之间，发芽率和硬实率与对照相比，均无显著差异(p>0.05)。

图11 30% H2O2处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果

3 讨 论

Acharya 等认为，机械处理能提高种子的发芽率，是商业用途的首选[21]。Carleton 等研究表明，划破鹰嘴豆种皮可以使其发芽率从20%提高到86%，并且处理后的种子发芽更快，田间出苗均匀一致[22]。Uzun 等认为，砂纸打磨能提高苜蓿和三叶草的发芽率[23]。杜建材等研究表明，砂纸打磨能完全破除扁蓄豆品系90-36种子的硬实率[24]。本研究采用多次打磨破除种子硬实，最终能使种子发芽率提高至98%。砂纸打磨简单、安全，而且对批量种子破除硬实时操作方便，在实际生产中的应用价值较大。

Carleton 等[22]以及Tomer 等[25]认为，浓H2SO4处理能破除豆科牧草的硬实；罗广军等研究表明，98% H2SO4浸种60 min能有效的破除甘草种子的硬实[26]；Long 等对黄芪进行不同时间梯度的浓H2SO4处理，结果表明，浓H2SO4处理30 min和处理40 min时能显著提高发芽率到94%～96%[27]。王玉珍等[28]用10%的H2SO4处理黄花苜蓿种子24 h，播种当年田间出苗率更均匀，幼苗数远远高于对照。该项研究的主要问题是用10%的H2SO4处理种子24 h，在实际应用中耗时长、不利于安全和操作。本研究采用98% H2SO4处理黄花苜蓿种子25 min、40 min、和60 min，均获得了较好的硬实破除效果，发芽率分别达到84%、88%和91%，三者之间差异不显著，为了安全操作(处理不超时、不损伤种子)和节省时间，在实际生产中，建议采用98% H2SO4处理种子25 min即可。

研究表明，H2O2能在一定程度上破除沙冬青种子的硬实[4]。本研究用30% H2O2处理20 min，可使黄花苜蓿种子硬实率有所下降(65%)，但下降幅度较小，H2O2的整体处理效果并不理想。Uzun 等[23]用25 mg·L-1赤霉素浸种处理，未能显著提高波斯三叶草(T.resupinatum)种子发芽率，却提高了另外2种三叶草(T.meneghinianum和T.striatum)的发芽率。本研究200 mg·L-1GA浸种6 h、400 mg·L-1GA浸种24 h和600 mg·L-1GA浸种6 h，对破除黄花苜蓿种子的硬实率均有一定的积极作用，但处理后的种子硬实率仍然较高，在59%～54%之间。

温度也是影响种子萌发的一个主要因素[29]。Imrie对绿豆进行高温干燥处理表明，125 ℃、150 ℃处理60 s和175 ℃、200 ℃处理30 s使发芽率提高到94%以上，硬实率下降到5%以下，175 ℃、200 ℃处理60 s能使硬实率下降到1%以下，但是种子受到伤害[30]。Uzun 等研究表明，3 ℃预冷7 d没有显著提高苜蓿的发芽率，浸入75 ℃水中处理5 min能使三叶草的发芽率由11%提高到82.8%[23]。Brant 等研究表明，高温干燥处理能降低种子的硬实率[31]。Long 等将黄芪种子放入网袋浸入沸水中10 min，有效破除了黄芪种子的硬实性[27]。本研究100 ℃热水处理、-18 ℃低温处理7 d、70 ℃高温处理0.5～3 h，均能部分打破黄花苜蓿种子硬实。液氮处理3、10、15 min也能显著降低黄花苜蓿种子硬实率，但是液氮处理对种子伤害较大，种子萌发后的死苗现象严重。

在其它化学处理中，0.3%和0.9% KMnO4处理4 h、10%的HCl处理40～80 min、10% NaOH处理20 min、40% NaOH处理10 min、以及0.2% NaCl浸种处理对打破黄花苜蓿种子硬实也有一定的积极效果，但处理后的硬实率还在60%左右。KNO3的所有处理对破除参试黄花苜蓿种子硬实的效果均不显著。

破除种子的硬实性，是农业生产中保证高效栽培的重要措施之一。但对植物来说，种皮暂时不受水和气体的影响，即使它们处于理想的发芽条件下也不会发芽，便产生硬实种子。硬实种子较耐老化，比软种子具有更好的耐贮藏性。硬实种子需要经过预处理才能在发芽前解除种皮的约束，是保证种子萌发在最有利环境下发生的生存策略，它能提高种子寿命和种群持久性。种子的高硬实性，通过防止季节降雨的萌发，有助于维持土壤种子库，它也是一种重要的环境适应和生存策略。同时，高硬实性也会导致植物种发芽期的延长，可以增加获得良好立地的机会。

4 结 论

13种方法破除黄花苜蓿种子硬实的效果不同。适度砂纸打磨处理破除黄花苜蓿种子硬实的效果最好，能使发芽率达到98%，硬实率降低至零。另外，98%的浓硫酸处理黄花苜蓿种子25～60 min，硬实率可下降到16%以下，即发芽率可达84%以上。其它处理的效果均不理想。