HPLC 法测定不同产地半夏及其伪品中4 种核苷

夏成凯杨葛俊刘耀武*

（1.安徽省中医药科学院亳州中医药研究所， 安徽 亳州236800； 2.亳州职业技术学院， 安徽 亳州236800； 3.安徽中医药大学， 安徽 合肥230031）

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.） Breit.的块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功效［1］，为临床常用中药，主产于甘肃、贵州、湖北等地。

半夏质量的优劣越来越受到人们的关注，其主要药效成分受到土壤、水分、气候、光辐射、生物传播等环境条件的影响，化学成分的含有量差异很大。

目前文献报道的半夏的化学成分主要为生物碱类、挥发油、核苷类成分［2-5］。吴皓等［5］从半夏中分离得到肌苷被作为其主要指标性成分，核苷类成分具有广泛的生理活性。

目前有研究［6-7］报道半夏代表性成分的含有量测定主要为生物碱类，部分关于核苷类成分的含有量测定方法［8-11］；许宏亮等［12］通过对半夏皮与块茎中4 类成分进行分析；阮洪根等［13］则对不同规格中半夏的核苷类成分进行分析。但对于不同产地半夏及其伪品中多种核苷类成分的含有量测定较少，特别是肌苷的含有量测定较少。由于半夏的价格较贵，市场上诸多伪品，如水半夏、天南星等直接影响其质量，主要从性状、显微等鉴别方法进行区分，无法实现定量鉴别［14-16］。

为了更好的探索不同产地半夏及其伪品中核苷类成分的含有量，建立多种核苷类成分的检测方法，更好的区分半夏及其伪品。本实验分别收集了来自甘肃、贵州、云南、河北、湖北的正品生旱半夏及来源于江西鞭檐犁头尖生水半夏、天南星、河北掌叶半夏、东北生天南星等，对尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷的含有量进行测定，以期建立快捷、方便、可靠的方法检测半夏中4 种核苷类成分，为不同产地半夏及其伪品的评价提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 BS200S 电子天平（杭州康纳科技有限公司）；Mettlertoledo 电子分析天平（百万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；DL-720D 超声波清洗器（杭州法兰特超声波科技有限公司）；RJ-TGL-16C型高速离心机（成都智楷分离科技有限公司）；UPH-Ⅱ-107型优普超型纯水器（西安优普仪器设备有限公司）；皖仪L600 高效液相色谱仪（安徽皖仪科技股份有限公司）。

1.2 试剂与药物 对照品尿苷（批号170329，纯度≥98%）、肌苷（批号161013，纯度≥98%）；鸟苷（批号130107，纯度≥98%）、腺苷（批号170417，纯度≥98%），均购于成都普菲德生物技术有限公司。乙腈（色谱纯）；高纯水（自制）。

9 批药材经亳州职业技术学院刘耀武教授鉴定为天南星科植物半夏属半夏Pinellia ternata（Thunb.） Breit.的干燥块茎、天南星科犁头尖属水半夏Typhonium flagelliforme（Lodd.） Blume.的干燥块茎、天南星科植物异叶天南星Arisaema heterophyllumBl.的干燥块茎、天南星科植物半夏属掌叶半夏Pinellia pedatisecia Schott.的干燥块茎。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取尿苷对照品10.108 mg，置于10 mL 量瓶中，加水溶液溶解并定容至刻度，精密量取1 mL 置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得尿苷对照品溶液。

精密称取肌苷对照品12.145 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密量取1 mL置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得肌苷对照品溶液。

精密称取鸟苷对照品16.128 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密量取1 mL置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得鸟苷对照品溶液。

精密称取腺苷对照品14.682 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，精密量取1 mL置于100 mL 量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得腺苷对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 称定半夏正品粉末（过3 号筛） 约2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL，称定质量，超声处理45 min（500 W，40 kHz），冷却至室温，再称定质量，用纯水补足减失质量，全部转移至离心管中，4 000 r／min离心5 min，取上清液1.5 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-AqC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -高纯水（B），梯度洗脱（0～15 min，100% B；15～20 min，100%～97%B；20～30 min，97%～85%B；30～40 min，85%～80% B；40～50 min，80%～100%B）；检测波长260 nm；柱温25℃；体积流量1 mL／min；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取“2.1.1”项下尿苷、肌苷、腺苷对照品溶液0.1、0.5、1、1.5、2.0 mL 置10 mL 量瓶中，用高纯水稀释至刻度，摇匀，得到不同浓度的进样对照品溶液。分别精密量取“2.1.1” 项下配制的鸟苷对照品溶液1、2、3、5、10 mL 置10 mL 量瓶中，用高纯水稀释至刻度，摇匀，得到不同浓度的鸟苷进样对照品溶液。在“2.2” 项色谱条件下，分别以上述各对照品溶液进样，每个浓度进样3 次，记录峰面积，取峰面积的平均值。以峰面积为纵坐标（Y），对照品的质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表2。表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验 分别量取尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样，进样量20 μL，重复6 次，记录色谱峰面积，RSD（n＝6） 分别为0.16%、0.21%、0.94%、0.06%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取河北产生旱半夏正品样品6 份，取“2.1.2” 项下供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样，记录色谱峰面积，结果尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷的RSD（n＝6） 分别为0.16%、0.59%、0.43%、0.41%，表示该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取来源于河北生半夏供试品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.2” 项色谱条件下进样，记录峰面积，尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷的RSD（n＝6） 分别为0.05%、0.03%、0.32%、0.27%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取6 份已知含有量的河北生半夏样品约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入已知含有量的尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷对照品溶液各1 mL，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样，计算加样回收率。结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4 样品含有量测定 对9 批样品中4 种不同的核苷类成分尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷进行测定，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（n＝6，μg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝6，μg／g）

3 结果与讨论

3.1 含有量比较 研究结果表明，不同产地的半夏与其伪品中各核苷的含有量差别较大，其中肌苷在贵州、云南产半夏中未检出；腺苷在贵州、云南产半夏及东北生天南星片中未检出；鸟苷在湖北产半夏及天南星中未检出；尿苷在贵州半夏与东北生天南星中未检出。半夏中4 种核苷总量在12.6～523.80 μg／g 之 间，水半夏中核苷总量为313.19 μg／g，天南星中核苷总量为252.7 μg／g，掌叶半夏核苷总量为1 055.70 μg／g，生天南星片核苷总量为102.5 μg／g。

在采集的半夏样品中，甘肃产半夏中肌苷、鸟苷、尿苷含有量较其他产地略高。目前市场上所用半夏产地也以甘肃为多；而在贵州产半夏中仅检测出鸟苷，肌苷、腺苷、尿苷均未被检出，这与其余4个产地半夏正品检测结果出入较大，此数据是否具有代表性，还有待进一步实验。通过对现阶段市场流通半夏伪品采样进行检测发现，掌叶半夏所含肌苷、腺苷、尿苷和鸟苷的含有量均较大，甚至比半夏正品的含有量大。目前市场上多用掌叶半夏混为天南星入药，甚至有多数省份将掌叶半夏看为质量较优的天南星药材，同时也存在与半夏通用的情况［17-18］，这可能与掌叶半夏中核苷类成分含有量较多有关。有文献研究报道，水半夏与半夏的药理作用基本相似，临床上可局部作为半夏的代替品［19-20］。

3.2 提取方法及色谱条件选择 本实验选择纯水、甲醇、乙醇、甲醇-水、乙醇-水等作为提取溶剂，结果显示纯水的提取效率较高。在提取方法的选择上，考察回流提取法、超声提取法等，结果超声提取效率较高。选择超声法提取的同时，对影响超声条件的功率、频率、提取时间进行考察最后选择超声功率500 W，频率40 kHz，提取45 min 效果最优。

色谱条件的选择上，分别比较了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸水等不同流动相对色谱峰的影响，结果乙腈-水分离效果较好。本实验选择用色谱柱Agilent ZORBAX SB-AqC18亲水柱进行实验，保证了条件的优化。

本实验对不同产地的半夏与其伪品中4 种核苷类成分进行含有量测定，建立的方法稳定、高效、快捷，以期有利于在种植、产地初加工、炮制等方面进行质量控制，同时为半夏的药效及毒性的物质基础研究提供依据。