海洋真菌Arthrinium sp.次级代谢产物的研究①

李基兴，李云秋

(桂林医学院药学院，广西 桂林 541004)

海洋广阔而独特的水体环境，赋予了代谢成分特殊的微生物资源和结构多样的海洋天然产物[1]。海洋微生物种类繁多，代谢方式独特，具有代谢产物化学多样性等特点，海洋真菌作为海洋微生物的重要组成部分，是新颖活性次级代谢产物的重要来源之一[2]。据报道，活性次级代谢产物已成为药物先导化合物发现的主要源泉，也为重大疾病的治疗和人类的发展进步做出了极其重要的贡献[3]。

本课题组一直致力于海洋来源真菌活性次级代谢产物的研究[4-5]，笔者对海洋来源的一株节菱孢菌属的菌株进行其次级代谢产物的研究，从其大米发酵产物中分离并鉴定了3个化合物，即：①2,3-dihydroxypropyl 9Z,12Z-octadecadienoate;②dibutyl phthalate;③1H-indole-3-carbaldehyde。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验样品

海洋来源的供试菌株保存于4 ℃环境中，将其接种到MB琼脂固体平面培养基上，置于28 ℃培养箱中活化7 d。然后接种到MB种子培养液(麦芽提取物1.5%，海盐1.5%，水10 ml)中于28 ℃ 、180 rpm条件下摇床活化3 d，最后再接种至大米培养基(大米200 g，海盐1.5%，水220 ml)中，室温下静置发酵60 d，共发酵40瓶。

1.2 菌株鉴定

通过提取菌株的总 DNA，并对 DNA 中的Intertek Testing Services(ITS)序列进行 PCR 扩增及18S rRNA对比(18S rRNA基因序列由上海美吉生物医药科技有限公司测定)，将测出来的18S rRNA 基因序列进行BLAST 分析(http:// blast. ncbi. nlm. nih. gov/)。鉴定为Arthriniumrasikravindrae(KU 940143)，菌种保存于中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室。

1.3 主要仪器与试剂

主要仪器：AV-700 超导核磁共振仪(德国 Bruker 公司)，中压制备色谱仪(Buchi 公司)，Hitachi Primade 高效液相色谱仪(日本日立公司)，ZYJ-S型超净工作台(苏州净化设备公司)，旋转蒸发仪(日本东京理化株式会社，EYELAN-1100V-W型)；主要试剂：葡聚糖凝胶 sephadexLH-20(Pharmacia 公司)，薄层色谱及柱色谱用硅胶(青岛海洋化工厂)，分析纯化学试剂(广州化学试剂厂和天津富宇精细化工有限公司)。

1.4 提取与分离

菌株发酵结束后将大米培养基捣碎，加入与捣碎物等体积的丙酮，超声15 min。然后用8层纱布减压过滤，滤液经减压蒸馏至无有机溶剂，再用乙酸乙酯萃取3遍，减压蒸干乙酸乙酯相得粗浸膏；残渣用乙酸乙酯提取3遍至乙酸乙酯浸提液颜色接近无色，再经浓缩得粗浸膏，合并二者得总浸膏共125 g。粗浸膏用100～200目的硅胶拌样，经中压柱色谱(200～300目硅胶)分离(二氯甲烷/甲醇：100∶0～1∶1)，梯度洗脱，再经TLC检识合并得8个流份。Fr.1经ODS中压反相柱色谱( MeOH/H2O：5%∶95%～100%∶0)分离得3个子流份，其中 Fr. 1-3再用半制备液相(CH3CN/H2O：18%∶82%)，得到化合物3(11 mg)；Fr.3经ODS中压反相柱色谱(MeOH/H2O：5%∶95%～100%∶0)分离得8个子流份，Fr.3-8再用半制备液相(CH3CN / H2O：64%∶36%)得到化合物1(22 mg)；Fr. 5 经ODS中压反相柱色谱(MeOH/H2O:5%∶95%～100%∶0)分离得8个子流份，其中Fr.5-8用半制备液相(MeOH/H2O：54%∶46%)得到化合物2(21 mg)。化合物结构如图1。

图1 化合物1～3的化学结构

2 结构鉴定

化合物1透明油状物：1HNMR(CD3OD, 700 MHz)δ：5.38(4H, m, H-9’, 10’, 12’, 13’), 4.17(1H, dd , J = 11.2, 4.2 Hz, H-1b), 4.09(1H, dd , J=11.9, 6.3 Hz, H-1a), 3.84 (1H, m, H-2), 3.57, (2H, t , J=4.9 Hz, H-3), 2.80 (1H, t , J=7.0 Hz, H-11’), 2.37 (2H, t , J = 7.0 Hz, H-2’), 2.09 (2H, m , J=7.0 Hz, H-8’), 1.64(3H, m, H-3’), 1.36 (6H, d , H-4’, 7’, 15’), 1.35(8H, m , H-5’, 6’, 16’,17’), 0.93(3H, t , J=7.7, 6.3 Hz, H-18’)；13CNMR(CD3OD, 175 MHz)δ: 175.48 (s, C-1’), 130.9 (d, C-9’), 130.8 (d, C-10’), 129.1 (d, C-12’), 129.0 (d, C-13’), 71.1 (d, C-2), 66.5 (t, C-1), 64.1 (t, C-3), 34.9 (t, C-2’), 32.7 (t, C-7’), 30.7 (t, C-15’), 30.5 (t, C-6’), 30.3 (t, C-5’), 30.2(t, C-4’), 30.1 (t, C-3’), 28.2 (t, C-8’), 26.5 (t, C-11’), 25.9 (t, C-16’), 23.6 (t, C-17’), 14.4 (q, C-18’)。化合物 1 的核磁数据与文献[6]对照基本一致，故鉴定该化合物为2,3-dihydroxypropyl 9Z,12Z-octadecadienoate。

化合物2透明油状物：1HNMR(CD3OD，700 MHz)δ: 7.72(2H, dd, J = 5.6, 3.5 Hz, H- 3, 6), 7.61(2H, dd, J=6.3, 3.5 Hz, H-4, 5), 4.29(4H, t, J=7.0 Hz, H-2’, 2’’), 1.72(4H, m, H-3’, 3’’), 1.46(4H, m, H-4’, 4’’ ), 1.31(2H, m), 0.97(6H, t, J=7.7Hz, H-5’, 5’’)。以上核磁数据与文献[7]对照基本一致，故鉴定该化合物2为dibutyl phthalate。

化合物3透明油状物：1HNMR(CD3OD，700 MHz)δ: 9.89(1H, s, H-8), 8.16(1H, d, J=7.7 Hz, H-4), 8.10(4H, s, H-2), 7.49(1H, d, J=8.4 Hz, H-7), 7.28(1H, td, J=7.0, 0.7 Hz, H-6), 7.24(1H, td, J=7.0, 0.7 Hz, H-5)；13CNMR ( CD3OD，175 MHz)δ: 187.4 (s, C-8), 139.7 (d, C-2), 138.9 (s, C-7a), 125.7 (s, C- 3a), 124.9 (d, C-6), 123.6(d, C-5), 122.4 (d, C- 4), 120.1 (s, C-3), 113.1 (d, C-7)。化合物3的核磁数据与文献[8-9]对照基本一致，故鉴定该化合物为1H-indole-3-carbaldehyde。

3 讨论

笔者对海洋来源真菌Arthriniumrasikravindrae的次级代谢产物进行了分离和鉴定，从中共获得3个化合物。据文献报道，化合物1是一种磷脂酶抑制剂，通过细胞膜释放花生四烯酸而缩短了促炎物质(前列腺素、白三烯、血栓烷)的生物合成时间，具有抗病毒、抗菌活性和抗炎活性[10]。随着海洋开采技术的发展，越来越多的海洋微生物资源将被开发和利用，本研究丰富了海洋来源真菌次级代谢产物的多样性，也为后续活性次级代谢产物的探索和药物先导化合物的发现及研究提供了参考。