五味子丙素缓解血管紧张素Ⅱ诱导的心脏炎性反应和心肌重构

谈云，叶琳岚，赵珺瑶，吕卫群

作者单位：无锡市第三人民医院（江南大学附属医院）药剂科，江苏 无锡214041

生理和病理性心脏结构重塑通常与血流动力学、心室形状和心肌力学的慢性改变有关，这些改变最初为了弥补心脏结构重塑而被触发，但最终加重了心肌重构[1-3]。细胞介导的机械转导反应对适应和非适应心肌与基质重塑起着重要调节作用[1]。机械负荷还可诱导血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、内皮素1和转化生长因子β（TGF-β）等因子的释放，这些因子是心肌细胞肥大和基质重塑的有效活化因子[4-6]。在器官和组织上，压力超负荷和运动诱导的生理性肥大时的同心肥大可以通过正常化壁应力或增加心输出量来达到稳态或代偿[7]。这些肥厚反应也可能伴随着细胞外基质（ECM）和冠状动脉系统的适应性重塑[8]。五味子是一种常用的中药，近年来临床用于治疗肝炎[9]，有研究报道五味子丙素可明显缓解四氯化碳诱导的肝损伤[10]，但在心血管疾病中五味子丙素的作用尚不明确。2018年7月至2019年1月，本研究以小鼠为对象，研究五味子丙素对AngⅡ诱导小鼠心肌重构的影响调节，为临床运用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 购自南京大学模式动物研究所[许可证号：SCXK（苏）2018-0008]。

1.2 药物与试剂 五味子丙素，购自美国selleck公司；逆转录试剂盒，实时定量PCR试剂盒，美国Invitrogen公司；血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ），美国Sigma公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）/白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒，美国eBioscience公司；RNA提取试剂，大连Takara公司。

1.3 主要仪器 倒置及正置荧光显微镜，日本Nikon公司；SpectraMaxM2型酶标仪，Molecular Devices生物科技公司；蛋白电泳、转膜与曝光系统，美国Bio-rad公司。

1.4 实验动物 选择8周龄的雄性C57BL/6小鼠24只，体质量为18～22 g，清洁级。在本研究中，24只C57BL/6小鼠被安置在一个12：12小时的光-暗循环中，在恒定的室温下，用标准的啮齿动物饲料喂养，并给予水。实验前，动物至少在实验室驯化2周。所有动物护理和实验程序均按照《实验室动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院）中概述的指令执行。经医院动物伦理审查委员会同意，实验用鼠均置于《实验动物管理条例》规定的标准条件下。

1.5 心室重构实验动物模型建立 皮下注射AngⅡ磷酸缓冲液（pH7.2）[0.5 mg·kg-1·（2d）-1，持续 8周]诱导10周大的C57BL/6小鼠心肌重构。将C57BL/6小鼠随机分为三组，每组各8只，对照组单独接受PBS的未经处理的C57BL/6对照小鼠；AngⅡ组为AngⅡ诱导的心肌重构小鼠；AngⅡ+ShC组为AngⅡ诱导的心肌重构小鼠，从AngⅡ注射前第1天开始口服五味子丙素（1%CMC-Na溶液），剂量为5 mg·kg-1·d-1，持续8周。PBS（磷酸缓冲盐溶液）组和AngⅡ组小鼠单独接受1%的CMC-NA溶液，时间与ShC治疗组相同。动物在戊巴比妥钠麻醉下被处死。小鼠死亡后，解剖心脏并称重，比较心脏质量/体质量（hw/bw，mg/kg），将心脏组织置于液氮中快速冷冻，进行基因和蛋白表达分析。此外，在死亡时，用含肝素的针注射器从右心室采集血液。

1.6 生化指标测定 用相应的试剂盒（江苏南京建成生物工程有限公司）检测血液中的生化分子肌酸磷化脢-同功脢CK-MB。

1.7 实时定量聚合酶链式反应 心脏组织（20～50 mg）由Trizol（Invitrogen，Arlsbad，CA）中根据说明书提取RNA。cDNA是通过转录酶和随机六聚体引物的作用下以mRNA为模版逆转录而成的。继而，利用实时定量PCR分析检测心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、肌球蛋白重链（MYHC）、IL-6、TNF-α、TGF-β、胶原IV（CollagenIV）和β-肌动蛋白（β-actin）mRNA的表达水平，引物序列见表1。

1.8 酶联免疫吸附实验测心脏中炎性因子的含量

TNF-α/IL-6水平检测：研磨组织并用蛋白裂解液提取，而后检测蛋白浓度。将TNF-α/IL-6的捕获抗体包被至96孔ELISA板，过夜放置于4℃。第2天，PBST（0.1‰Twen-20的PBS）洗涤3次，每次均置于吸水纸上将剩余液体拍干，后向已包被的ELISA板加入BSA封闭，1 h后弃BSA并将细胞培养上清液加入至ELISA板中，于室温摇床放置2 h。随后PBST洗涤3次，将TNF-α/IL-6的检测抗体加入至ELISA板，于室温摇床放置1 h。随后PBST洗涤3次，将Strapavaidin-HRP加入至ELISA板，于室温摇床放置30 min。随后将HRP显色底物（TMB）加入至ELISA板，于室温避光放置15 min，而后将终止缓冲液（4%硫酸）加入至ELISA板，利用酶标检测仪，设置参数为450 nm，测定吸光度

表1 实时定量聚合酶链式反应的引物序列

1.9 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，所有计量资料以表示。两组间的比较采用Student's t检验分析，多组间的差异比较采用单因素方差分析并以Bonferroni校正作后比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五味子丙素显著减轻AngⅡ诱导的体内心脏损伤 每组8只小鼠，分别每两天皮下注射注射0.5 mg/kg的AngⅡ诱导小鼠心脏损伤。在小鼠死亡后，我们检测了血清CK-MB水平。PBS组为（120.9±18.95）μmol/L，AngII组为（198.0±36.43）μmol/L，AngII+ShC组为（113.5±39.47）μmol/L，三组间CK-MB水平比较，F＝12.57，P＝0.000 5；AngⅡ诱导CK-MB水平升高，五味子丙素处理显著降低。

2.2 给予五味子丙素可显著减轻AngⅡ诱导的心肌重构 图1A显示皮下注射AngⅡ可诱导小鼠心重比升高，而五味子丙素处理可得到缓解[AngⅡ组比AngⅡ+ShC 组为（6.32±0.99）‰比（4.93±0.17）‰，P＜0.05]，并且AngⅡ注射液和五味子丙素治疗均不影响实验小鼠的体质量变化（图1B）。五味子丙素处理抑制了AngⅡ诱导的心功能相关基因ANP[（3.37±0.60）比（1.41±0.37）倍，P＜0.05]、BNP[（2.51±0.75）比（0.78±0.55）倍，P＜0.05]、促肥大基因 MYHC[（2.57±0.74）比（1.18±0.26）倍，P＜0.05]的mRNA过度表达（图1C）。此外，AngⅡ组比AngⅡ+ShC组分别 为（3.70±1.47）比（1.68±0.56）倍 、（5.25±0.94）比（1.78±0.57）倍（P＜0.05），见图1C，并且发现AngⅡ可升高小鼠血压，但五味子丙素治疗却不改善血压的升高，AngⅡ组比AngⅡ+ShC组为（132.50±8.86）比（133.10±12.16）mmHg，差异无统计学意义（图1D）。

2.3 五味子丙素可显著抑制AngⅡ诱导的小鼠心脏炎症 实时qPCR分析显示，与对照组相比，AngⅡ组小鼠的TNF-α和IL-6的mRNA表达显著增加，而五味子丙素处理后，这些因子表达的增加被明显抑制，AngⅡ组比AngⅡ+ShC组分别为（7.18±2.85）比（2.92±0.86）倍，（12.89±5.40）比（4.29±3.43）倍，P＜0.05）（图2A）。通过ELIAS检测心脏中TNF-α和IL-6的蛋白水平，结果显示AngⅡ组小鼠的TNF-α和IL-6的蛋白水平显著升高，而服用五味子丙素可显著降低这些升高[AngⅡ组比AngⅡ+ShC组分别为（4.80±0.78）比（2.09±0.41）ng/mg，（2.56±0.73）比（1.23±0.41）ng/mg，P＜0.05]（图2B）。

图1 五味子丙素显著减轻Ang II诱导的心肌重构：A为小鼠心脏质量体重量比，B为小鼠体质量变化，C为小鼠心脏ANP、BNP、MYHC、Collagen IV、TGF-β的mRNA水平变化，D为小鼠血压变化

图2 五味子丙素可显著抑制AngⅡ诱导的小鼠心脏炎症：A为小鼠心脏IL-6和TNF-α的mRNA水平，B为小鼠心脏IL-6和TNF-α的蛋白水平

3 讨论

心力衰竭是大多数心血管疾病病人最主要的死亡原因，病人的医疗费用也是社会沉重经济负担的重要组成部分[11-13]。在心力衰竭的病理发展过程中，心肌重构起着至关重要的作用[14]。心肌重构是心脏的一种适应性反应，发生在各种外在和内在刺激中，这些刺激会增加生物力学压力[12]。因此，了解心肌重构的机制和潜在靶点对心血管生物学领域很重要，并可能成为预防或治疗心血管疾病的新策略。临床和实验研究表明，AngⅡ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应物，在导致心肌重塑的生物学过程中具有重要作用[1，15]。除了其在动脉血压调节中的生理作用（即通过血管收缩和钠水滞留），AngⅡ还通过激活心脏炎症直接诱导心肌重构[16-17]。许多研究支持AngⅡ对心肌细胞有着直接影响，包括心肌细胞炎症、肥大、纤维化和细胞外基质的积累[7，16，18]。在我们的研究中发现五味子丙素可在不改变小鼠体质量（图1B）以及AngⅡ诱导的血压升高（图1D）条件下，改善AngⅡ引起的心重比升高（图1A）。除此之外，心功能相关指标ANP和BNP的mRNA水平在AngⅡ诱导下显著升高，表明AngⅡ引起心功能紊乱；然而，五味子丙素治疗后，AngⅡ诱导的ANP和BNP明显下调（图1C）。胶原生成增多是心肌重构中的重要一环，我们研究发现，皮下注射AngⅡ后，Collagen IV和TGF-β显著上升，而五味子丙素可逆转这些变化（图1C）。以上表明五味子丙素可改善AngⅡ诱导的心肌重构。

AngⅡ诱导的心肌炎症是心肌重塑和心力衰竭的关键因素之一[16-17，19]。文献报道阻断TLR4（经典炎症信号通路的上游蛋白）可减轻AngⅡ诱导的心肌炎症，并改善高血压引起的心脏功能紊乱[20]。Echem等人发现，局部炎性反应（如促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的增加）在高血压相关的心肌重构中起着关键作用，而TLR4依赖的免疫抑制可缓解心肌纤维化和肥大，且血压水平无变化[21]。除此之外，Matsuda等[22]证明以TLR4缺陷小鼠为实验模型，TLR4缺乏逆转了AngⅡ诱导的心脏肥大、单核细胞/巨噬细胞浸润和舒张功能障碍，且血压水平无变化。因此，除了经典的AT1受体和高血压，炎症反应被认为是连接AngⅡ与心脏疾病的一个纽带。本研究发现AngⅡ可诱导心脏组织中炎性因子（TNF-α和IL-6）的过度表达，而五味子丙素治疗可显著缓解（图2）。因此我们推测五味子改善AngⅡ诱导的心室重构可能源于其抗炎作用。但并未进一步深入探索，此为本研究的局限。

综上所述，本研究发现五味子丙素能有效抑制AngⅡ诱导小鼠的心肌重构，并伴随炎性反应的降低，表明五味子丙素可能成为治疗心肌重构的候选药物。