氩气贮藏对玉米种子老化过程中活力及生理特性的影响

田茜，段乃彬，张文兰，李群，颜廷进，戴双，丁汉凤

（山东省农作物种质资源中心，山东 济南 250100）

种子使植物能够在恶劣环境下生存，并将遗传信息传给下一代。然而种子成熟后，随着贮藏时间延长其生理生化状态会发生一系列变化，导致其生活力、活力逐渐下降，直至衰老死亡，这种伴随着种子贮藏时间的增加而发生和发展的自然的不可逆的过程，即为种子劣变或老化［1］。种子老化过程中会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS会导致种子内部发生一系列的生化裂变，包括膜透性增加、酶活性降低、贮藏物质减少等［2-4］。种子老化不仅能够降低种子贮藏期间的生活力，同时也是影响植物生长发育和作物产量的主要原因之一［5］。在农业生产中，种子老化会导致巨大的经济损失和遗传资源损失［6］。因此，如何延缓种子老化及提高老化种子活力的研究备受关注，研究种子老化过程中的各种生理生化变化、提高种子活力和保存期限，对农牧业生产和种质保存有着重要的指导意义。

种子含水量、贮藏温度和气体成分是影响种子贮藏寿命的关键因素，调控适宜的贮藏条件可以延缓种子老化速度，提高种子贮藏寿命。气调贮藏作为一种绿色环保、安全有效的贮藏技术，通过控制气体成分来降低氧含量，从而有效降低种子贮藏过程中的氧化损伤，延长种子的贮藏寿命，得到越来越多的关注。目前，气体对种子贮藏过程中活力及品质影响的研究主要集中在N2和CO2。罗广华等［7］研究发现，N2和CO2有延缓38～40℃人工老化贮藏花生种子老化的效果；涂杰等［8］对比了CO2气调储藏与常规储藏对粳籼稻谷品质的影响，发现CO2气调储藏比常规储藏品质变化缓慢；王若晖等［9］也发现，高温下充CO2气调储藏能延缓青稞品质的降低。近年来开展充氮气调贮藏对种子品质影响的研究较多，研究发现充氮气调可以有效减缓高温对玉米、高粱、籼糙米品质的影响［10-12］；付家榕等［13］研究发现，充氮气调能在一定程度上延缓大豆贮藏过程中的老化。

氩气（Ar）属于惰性气体，无毒无味，化学活性低，价格低廉。用氩气进行瓜果蔬菜保鲜是近年的一种新颖的食品保鲜技术。在一定的压力下，氩气可以与水果和蔬菜细胞间的水分子形成一种特殊的“笼形水合物”［14］，这种水合物不仅限制了水果和蔬菜中水分子的活动，而且能抑制酶活性和代谢生理活动，降低呼吸速率，最终抑制其褐变和成熟，从而达到保鲜的效果［15，16］。该技术具有无毒副作用、操作简单、效果明显等优点，得到了越来越多的关注。但目前尚未见氩气用于种子保存及其对种子老化影响的相关报道。因此，本研究用人工老化模拟自然老化，采用氩气和空气贮藏两种方式，研究氩气气调贮藏对玉米种子老化过程中活力和生理生化特性的影响，探讨氩气对种子老化的影响，以期为种子安全保存新方法的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与处理方法

试验所用玉米（Zea mays L.）品种为‘郑单958’，由山东省农作物种质资源中心种质保存中期库提供。种子初始发芽率为99%，初始含水量为10.2%。

取种子样品500 g储存于广口瓶中用双孔塞子进行密封，按图1工艺充入氩气，用气体分析仪检测气体浓度，当模拟仓内充满氩气时，立即关掉阀门，密封瓶口。以充满空气为对照。将种子置于60℃的人工老化箱内进行老化处理，每隔12 h取样，测定种子活力及各项生理指标。

图1 模拟仓充氩气工艺流程

1.2 生理指标的测定

发芽指标的测定参照国际种子检验协会（ISTA）的《种子检验规程》（1996）［17］进行。随机选取100粒种子，放入铺有两层滤纸的发芽盒中，重复4次，将发芽盒置于25℃恒温培养箱中黑暗培养，每日统计发芽种子数。发芽结束后分别计算不同处理种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数。

发芽势Gp＝第3 d时发芽种子数/种子总数×100%；

发芽率G＝第7 d时发芽种子数/种子总数×100%；

发芽指数GI＝Σ（Gt/Dt）；

活力指数VI＝GI×DW。式中，Gt为第t天发芽种子数，Dt为相应发芽天数，DW 为幼苗干重。

种子电导率：取3份玉米种子，每份20粒，用去离子水冲洗3次，迅速用滤纸吸干种子表面水分，置于100 mL三角瓶中，加入30 mL去离子水，置于25℃恒温培养箱中24 h。用METTLERTOLEDO 326电导率仪（Delta 326，METTLERTOLEDO，China）测定种子初始电导率（a1），然后将种子及其浸出液置于100℃水浴中煮沸30 min，取出冷却至25℃，测定煮沸后种子浸出液的电导率（a2）。根据公式计算浸出液的相对电导率。

相对电导率（%）＝（a1/a2）×100。

将老化不同时间的玉米种子置于湿润滤纸上吸胀24 h，剥取吸胀种胚测定丙二醛（MDA）和H2O2含量、超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）、抗坏血酸过氧化物酶（APX，EC 1.11.1.7）活性［18］。蛋白质浓度测定采用Bradford法［19］，以牛血清白蛋白为标准。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据统计与显著性分析。

2 结果与分析

2.1 氩气气调贮藏对玉米种子萌发特性的影响

由表1可以看出，种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均随着老化时间的延长而逐渐降低。空气贮藏条件下各指标下降幅度较大，氩气贮藏条件下各指标下降较空气贮藏的缓慢，延缓了玉米种子的老化进程。在老化初期（12 h），空气贮藏和氩气贮藏种子的发芽指标差异不显著；老化24 h后，二者的萌发指标均差异显著，此时，氩气贮藏仍能保持92.00%的发芽率，而空气贮藏的发芽率已降至78.00%，发芽势、发芽指数和活力指数也分别比空气贮藏的提高了42.62%、19.75%、28.71%。至老化48 h时，氩气贮藏种子的发芽率为52.00%，而空气贮藏的仅为17.00%；氩气贮藏种子的发芽势、发芽指数和活力指数也维持在中等水平，而空气贮藏的则均处于较低水平。人工老化72 h后，空气贮藏种子的发芽率降为零，而氩气贮藏的发芽率仍为17.00%。此外，空气贮藏条件下种子发芽率下降50%的时间约为36 h，而氩气贮藏的约为48 h。由此可见，氩气贮藏延缓了种子活力下降的速度，对延缓种子老化进程、延长种子寿命具有一定的作用。

表1 气调贮藏条件下老化不同时间玉米种子的发芽情况

2.2 氩气气调贮藏对玉米种子浸出液电导率及MDA和H2 O2含量的影响

MDA是不饱和脂肪酸氧化的最终产物，其含量高低是衡量脂质过氧化程度的重要指标。种子浸出液电导率是表示细胞膜完整性的重要指标。图2显示，在空气贮藏和氩气贮藏条件下，种子浸出液的相对电导率、MDA和H2O2含量均随老化时间的延长逐渐升高。氩气贮藏的相对电导率、MDA和H2O2含量均低于空气贮藏，且从老化24 h开始，二者差异显著。人工老化36 h时，氩气贮藏玉米种子的电导率、MDA和H2O2含量比空气贮藏分别降低了22.87%、26.84%、33.02%。表明，随着老化时间的延长，种子中活性氧（ROS）大量产生并积累，但氩气贮藏在一定程度上抑制了老化种子中ROS的产生，降低了脂质过氧化程度，有效缓解了老化引起的氧化损伤。

图2 老化不同时间玉米种子的相对电导率及MDA和H2O2含量变化

2.3 氩气气调贮藏对玉米SOD、APX活性的影响

SOD和APX是清除活性氧的重要抗氧化酶。SOD是抗氧化系统的第一道防线，它可以把O·-2歧化成H2O2。APX是ASC-GSH循环中的关键酶，也是清除H2O2的主要酶。由图3可知，在两种贮藏方式下，玉米种胚中SOD、APX活性表现出相同的变化趋势，都在老化初期增加，而后迅速下降，氩气贮藏的酶活性显著高于空气贮藏。老化12 h，SOD、APX活性达到峰值，空气贮藏的较未老化的分别增加5.17%、4.10%，氩气贮藏的则分别增加19.25%、15.57%，且氩气贮藏种子的酶活性显著高于空气贮藏，分别比空气贮藏高出13.39%、11.02%。老化48 h，与空气贮藏相比，氩气贮藏种子种胚中SOD、APX活性分别高出86.25%、46.43%。表明人工老化过程中，氩气贮藏抑制了种子中SOD、APX活性的降低，维持了较高的保护酶活性，提高了老化种子抵御ROS侵害的能力。

图3 老化不同时间玉米种子的SOD、APX活性

3 讨论与结论

老化是贮藏过程中影响种子质量和活力的主要因素。本研究结果表明，在人工老化过程中，反映玉米种子萌发特性的各个指标（发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数）均下降，这与孙守江等的研究结果一致［20］，与空气贮藏相比，在氩气贮藏条件下玉米种子各萌发指标降速缓慢，这与CO2气调［7-9］和充氮气调［10-13］对种子老化研究的结果一致。罗广华等［7］推测，这与种子的气相缺氧有关，充氩气贮藏实质上是阻断了O2与种子接触，直接抑制了种子的呼吸作用；而种子呼吸作用的减弱又可以减少呼吸链中ROS的产生，降低细胞的脂质过氧化程度和其他细胞器损伤，从而延缓种子老化。

老化的自由基理论认为，ROS的产生和积累是导致种子老化的主要原因；在种子贮藏过程中，ROS的积累会导致脂类、DNA和蛋白质的氧化损伤，从而导致种子萌发能力降低，活力丧失［21］。本试验中随着老化时间的延长，种子中H2O2逐渐积累，MDA含量和相对电导率不断增加，这与前人对玉米的研究结果一致［22-24］，说明老化导致ROS积累，引发了膜脂过氧化，细胞膜透性增加。SOD、APX是植物体内ROS的清除剂，可以使细胞内的ROS维持在正常水平，防止氧化损伤。本试验中SOD、APX活性均逐渐降低，这与鲜萱等［25］的研究结果一致，说明老化导致种子的抗氧化能力下降。而在氩气贮藏条件下，与空气对照相比，相对电导率、MDA和H2O2含量增加缓慢，SOD、APX活性降低也缓慢，说明氩气贮藏延缓了种子裂变的速度。这可能是由于氩气降低了脂质的氧化程度，减少了ROS的产生和积累，同时又通过维持较高的抗氧化酶活性，不断清除ROS，避免ROS过量积累，从而降低其对细胞的氧化损伤，延缓种子的老化进程。

综上所述，相较于空气贮藏，氩气贮藏能够减缓玉米种子各萌发指标的降低速度，降低种子的相对电导率及MDA和H2O2含量，提高SOD、APX活性，在一定程度上延缓了玉米种子的老化进程。