不同品种花生衣原花青素含量及抗氧化活性研究

宋昱，方策，2，马飞，张初署，于丽娜，毕洁，王明清，于淼，迟晓元，张建成，孙杰，江晨

（1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100；2.山东师范大学，山东 济南 250014；3.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉 430062；4.辽宁省农业科学院食品与加工研究所，辽宁 沈阳 110161）

花生属于油料作物，它作为重要创汇农产品和具有很强国际竞争力的大型农产品［1］，近年来在国内市场和世界贸易中的地位及影响力一直处于上升状态［2］。我国花生产量及出口量从2000年以来一直稳居前列［3］。花生在农产品经济和贸易中的地位十分重要［4-6］。

花生衣是花生的种皮，具有止血、化瘀、消肿等功效。它主要由蛋白质、纤维素、脂肪、灰分以及少量单宁、色素等物质组成［7-9］。花生衣含有多种活性成分，其中引起较多关注的是原花青素［10］。

原花青素（proanthocyanidin，PC）广泛存在于很多植物中，其基本结构是有C6-C3-C6骨架，具有水溶性、醇溶性、无毒无过敏性。PC属于酚类物质，主要由儿茶素单体、表儿茶素单体、表儿茶素没食子酸酯单体、没食子酸单体、原花青素B1、原花青素B2以及由单体通过C4-C6键、C6-C8键结合而形成的低聚体、高聚体等组合而成的混合物。原花青素具有很好的功能活性［11］，能够抑制肿瘤、改善人体微循环、抗炎、抑制血小板凝聚及脂质过氧化，还能提高人体免疫力、预防紫外线辐射、抗衰老、抗疲劳、抗基因突变、保护心血管等［9，12-21］。PC还可通过抑制葡萄糖苷酶、淀粉酶、蛋白-酪氨酸磷酸酶等起到预防糖尿病的作用［22］；也可通过抑制乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱脂酶、淀粉样前体蛋白裂解酶来抑制淀粉样肽的自我聚集，可提高突触的可塑性以及改善大脑血流，提高血浆的还原能力［23］。因此原花青素可以被开发成防治心脑血管的药物、天然的抗氧化剂以及绿色化妆品等［14，24］。国外以葡萄籽中原花青素作为主要活性成分的药品或者食品的营养补充剂已经深入人们的日常生活［25，26］，而国内对这类产品的开发才刚刚起步，但发展势头很好，目前有不少企业正在着手这一类产品的研发以及生产［2，27，28］。

将花生衣中的原花青素提取出来作为药物或者食品中的有效成分，是近年来研究的热点。我国是花生生产大国，花生衣作为花生加工后的主要副产物，每年都会有几十万吨的产量。将花生衣作为提取原花青素的来源，不仅是对加工副产物的有效利用，而且还能带来经济利益。从原料方面来说，花生衣的来源广且价格低，具有成本低的突出特点；从提取工艺来说，它操作简便，仪器与试剂较易获得，最终的提取率较高；从市场方面来说，它符合我国新时代的发展模式，具有很好的应用前景。本试验以白玉花生、黑花生2号及花育23为材料，研究不同品种、不同种皮颜色、不同生长时期花生衣中的原花青素含量、组成及抗氧化活性，以期为花生衣高活性原花青素提取及进一步应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

2019年7—8月在山东省花生研究所莱西试验站获取白玉花生、黑花生2号及花育23各品种花生下针后30天和50天的花生衣。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，SIGMA-ALDRICH）和三羟甲基氨基甲烷（Tris，SIGMA-ALDRICH）及对照品儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、没食子酸、原花青素B1、原花青素B2等，均购自北京索莱宝科技有限公司；甲醇、乙腈、四甲基乙二胺为色谱级试剂，其余均为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器与设备

主要有：紫外分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司产品）；HPLC-1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司产品）；真空冷冻干燥机（美国西盟国际金西盟仪器有限公司产品）；循环水式多用真空泵（上海知信试验仪器技术有限公司产品）；Centrifuge 5430R高速离心机（德国Eppendorf公司产品）。

1.3 试验方法

1.3.1 不同品种花生衣原花青素提取 将白玉花生、黑花生2号、花育23各品种花生下针生长30天和50天的花生衣样品分别命名为白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）。分别取各样品2 g放入研钵中研磨30 min，按照1∶5的料液比加入80%乙醇，于40℃超声波处理20 min，将滤渣再重复提取2次，之后滤液混合定容到50 mL。取粗提液各0.5 mL，用80%乙醇稀释4倍，供后续试验使用。

1.3.2 原花青素含量测定 具体方法如下。

（1）原花青素标准曲线制作：称取原花青素标准品10 mg用80%乙醇溶解，然后定容于10 mL棕色容量瓶中，得到1 mg/mL原花青素乙醇标准液，然后稀释至0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL浓度梯度。分别取0.5 mL放入试管中，加入4%香草醛甲醇溶液3 mL，混匀，再加入浓盐酸1.5 mL，彻底混匀，室温下显色15 min左右，于500 nm波长下测定吸光度，记录数据制作标准曲线［29-33］。

（2）原花青素含量测定：按照上述原花青素含量测定方法即香草醛-盐酸法测定6个样品的吸光度值，每个样品平行测3次。

1.3.3 不同品种花生衣原花青素组分HPLC分析 具体方法如下。

（1）色谱分析条件：色谱柱为kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温30℃；流动相为0.3%磷酸-乙腈（9∶1，V/V），流速0.7 mL/min，进样量10μL，检测波长278 nm。测定峰面积并带入标准曲线方程中计算各待测液的原花青素含量。

（2）花生衣样品液的组分测定：用针管吸取样品液0.4 mL，0.22μm微孔滤膜（有机相）过滤到1.5 mL棕色小瓶中，上样分析。

1.3.4 抗氧化活性测定 具体方法如下。

（1）不同品种花生衣原花青素DPPH自由基清除试验：取上述6种提取物的稀释液各0.5 mL分别放于EP管中，均加入4.5 mmol/L DPPH溶液0.5 mL，充分混匀，室温下反应20 min，于波长517 nm处测定吸光度，空白对照组以0.5 mL蒸馏水代替待测液，每个样品重复测定3次［34］。按照以下公式计算样品对自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ao］×100 。

式中，Ai为样品与DPPH混合液吸光度；Aj为样品与无水乙醇混合液吸光度；Ao为DPPH与无水乙醇混合液吸光度。

（2）不同品种花生衣原花青素羟自由基清除试验：取上述6种提取物的稀释液各0.25 mL分别放于EP管中，均加入6 mmol/L七水合硫酸亚铁0.25 mL，充分混匀，再加入6 mmol/L水杨酸液0.25 mL及6 mmol/L过氧化氢0.25 mL，混合均匀后37℃水浴加热1 h，再于波长510 nm处测定吸光度，对照组以0.25 mL蒸馏水代替待测液，每个样品重复测定3次［35］。按照以下公式计算样品对自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Am-An）/Ap］×100 。

式中，Am为样品与FeSO4、H2O2混合液吸光度；An为样品与FeSO4、蒸馏水混合液吸光度；Ap为蒸馏水与FeSO4、H2O2混合液吸光度。

（3）不同品种花生衣原花青素超氧阴离子自由基清除试验：取上述6种提取物的稀释液各0.5 mL分别放于EP管中，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）缓冲液1.25 mL，25℃水浴保温20 min后，加入25 mmol/L邻苯三酚溶液0.5 mL，5 min后加入10 mol/L HCl溶液0.5 mL，于320 nm处测定吸光度，空白对照组以0.5 mL蒸馏水代替待测液，每个样品重复测定3次［36］。按照以下公式计算样品对自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Ah-Ak）/Aq］×100 。式中，Ah为样品与Tris-HCl、邻苯三酚、HCl混合液吸光度；Ak为样品与Tris-HCl、蒸馏水、HCl混合液吸光度；Aq为蒸馏水与Tris-HCl、邻苯三酚、HCl混合液吸光度。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel处理数据与作图。

2 结果与分析

2.1 不同品种花生衣原花青素含量的确定

2.1.1 原花青素标准曲线的确定 原花青素含量标准曲线如图1所示，其线性方程为y＝1.772x+0.0082（R2＝0.9989）。

图1 原花青素标准曲线

2.1.2 不同品种及生长时期花生衣的原花青素含量 由表1可知，白玉花生、黑花生2号、花育23花生下针后30天，其PC含量表现为花育23＞黑花生2号＞白玉花生；下针后50天，白玉花生、黑花生2号、花育23花生衣的PC含量均提高，且仍以花育23最高，达0.234 g/g，白玉花生最低，仅为0.003 g/g。与30天时相比，3个品种花生衣的PC含量表现为分别提高1.50、3.41倍和3.20倍。

表1 不同品种花生衣的原花青素含量

2.2 不同品种花生衣的原花青素组分分析

2.2.1 原花青素标准品的HPLC图谱 原花青素B1、原花青素B2、表儿茶素、儿茶素、没食子酸和表儿茶素没食子酸酯共6个标准品的HPLC图谱如图2所示。其标准曲线的线性方程为：（a）y＝5503.7x+19.567（R2＝0.9999）；（b）y＝5116.8x+29.466（R2＝0.9997）；（c）y＝6467.6x-4.0575（R2＝0.9986）；（d）y＝7103.2x+58.962（R2＝0.9983）；（e）y＝5607.5x+25.147（R2＝0.9981）；（f）y＝6829.1x+27.613（R2＝0.9989）。

图2 原花青素B1（a）、原花青素B2（b）、表儿茶素（c）、儿茶素（d）、没食子酸（e）和表儿茶素没食子酸酯（f）标准品的HPLC图谱

2.2.2 不同品种花生衣原花青素提取液组分测定结果 根据3个品种花生衣PC提取液结果（图3）及其标准品HPLC图谱（图2）进行分析，可知，白花生3 PC提取液中含有没食子酸和原花青素B1单体，其中没食子酸含量为0.134 mg/g，原花青素B1含量为0.0746 mg/g；黑花生3 PC提取液中含有原花青素B2和没食子酸单体，其中原花青素B2含量为0.0344 mg/g，没食子酸含量为0.164 mg/g；花育23（3）PC提取液中含有儿茶素、没食子酸、表儿茶素及表儿茶素没食子酸酯等单体，其中儿茶素含量为0.117 mg/g，没食子酸含量0.169 mg/g，表儿茶素含量为0.209 mg/g，表儿茶素没食子酸酯含量为0.0548 mg/g；白花生5 PC提取液中含有没食子酸单体，其含量为0.169 mg/g；黑花生5 PC提取液中含有原花青素B2、没食子酸、表儿茶素、儿茶素及表儿茶素没食子酸酯等单体，其中原花青素B2含量为0.593 mg/g，儿茶素含量为0.0808 mg/g，表儿茶素含量为0.150 mg/g，没食子酸含量为0.113 mg/g，表儿茶素没食子酸酯含量为0.369 mg/g；花育23（5）PC提取液中含有没食子酸、表儿茶素、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯等单体，其中儿茶素含量为1.302 mg/g，表儿茶素含量为0.316 mg/g，没食子酸含量为0.0272 mg/g，表儿茶素没食子酸酯含量为0.182 mg/g。根据以上结果可知，50天时各品种花生衣中PC单体的种类和含量与30天时具有明显差异，其中黑花生5含单体种类最多，花育23（5）单体含量最高，而白玉花生花生衣中PC的单体种类和含量均不如其它两个品种。

图3 白花生3（a）、黑花生3（b）、花育23（3）（c）、白花生5（d）、黑花生5（e）和花育23（5）（f）PC提取液的HPLC图谱

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 不同品种花生衣原花青素清除DPPH自由基效果 由图4可知，所有品种花生衣PC提取液对DPPH自由基均具有一定的清除能力，但其清除能力不同。黑花生和花育23花生衣PC提取液的清除能力相对于白花生较强，其中清除能力最强的是花育23（5），达87.72%；清除能力最弱的是白花生3，仅为11.26%。表明，种皮颜色较深的黑花生和花育23其花生衣PC提取物清除DPPH自由基的能力优于颜色较浅的白花生；随生育时间延长，3个品种花生衣PC清除DPPH自由基的能力均有提高。该结果与2.1.2原花青素含量测定结果一致。相关研究表明，原花青素清除DPPH自由基能力的强弱与含量呈正相关，浓度越大，清除效果越明显［37］。

图4 PC提取液清除DPPH自由基能力

2.3.2 不同品种花生衣原花青素清除羟自由基效果 由图5可知，白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）花生衣PC提取液清除羟自由基的效果均较好，最强的是花育23（5）花生衣PC提取液，高达84.61%，最弱的是白花生3仅为42.40%。随生育时间延长，3个品种花生衣PC提取液清除羟自由基的能力均有提高。综合看，各品种花生衣PC提取液清除羟自由基能力：花育23＞黑花生＞白玉花生。

图5 PC提取液清除羟自由基能力

2.3.3 不同品种花生衣原花青素清除超氧阴离子自由基效果 由图6可知，白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）花生衣PC提取液对超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力，但不同品种和生育时间对其清除能力影响较大。其中清除效果最好的是花育23（5），高达93.86%；清除效果最差的是白花生3，只有7.69%。随着生育时间延长，下针后50天3个品种花生衣PC提取液清除超氧阴离子自由基的能力均优于30天的样品。相关研究表明，原花青素可以通过抑制邻苯三酚在碱性条件下的自氧化而实现超氧阴离子自由基（）的清除，并且其清除能力强弱同样与含量呈正比，本试验结果与其测定结果一致［34］。

图6 PC提取液清除超氧阴离子自由基能力

3 结论

本试验以白玉花生、黑花生2号和花育23各品种新鲜花生衣为原料，采用超声波技术辅助、80%乙醇提取花生衣中的原花青素，用香草醛-盐酸法及高效液相色谱（HPLC）法对原花青素单体组成含量及抗氧化活性（清除自由基能力）进行测定。结果表明，花育23（5）的原花青素含量最高，为0.234 g/g；3个品种花生衣原花青素组分中的单体种类及含量不同；清除DPPH自由基、羟自由基及超氧阴离子自由基能力最强的均是花育23（5）花生衣PC提取液，最弱的均是白花生3花生衣PC提取液。本研究可为将花生衣原花青素开发成天然抗氧化剂提供一定参考。