泰山不同海拔土壤的细菌多样性初步分析

沈开强，韩晓彤，张銮，李毅璞，丁延芹，杜秉海，汪城墙

（山东农业大学生命科学学院/山东省农业微生物重点实验室，山东 泰安 271018）

土壤中细菌的数量和种类繁多，是土壤生物类群的重要组成部分，参与土壤中几乎所有的生化反应，在有机物分解、生物地球化学循环等方面起重要作用，对土壤肥力和生态系统结构的形成有显著影响［1-3］。细菌对环境变化较为敏感，所以常常将土壤细菌作为评价环境的重要指标。

随着山体海拔的升高，气温、降水、土壤等因素各不相同，势必影响山体土壤细菌的群落组成和丰富度。近几十年来，中外科学家对山体不同海拔的微生物分布差异做了大量研究工作。金裕华［4］发现，武夷山土壤真菌数量随海拔升高而降低，土壤放线菌数量随海拔升高而升高，土壤细菌和纤维素分解菌数量随海拔升高而增加，固氮细菌和氨化细菌随海拔的升高而降低。Bryant等［5］发现，落基山脉随着海拔升高细菌类群丰富度、系统发育多样性降低。张丹丹等［6］研究表明，革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的多样性与珠穆朗玛峰海拔呈负相关。综上所述，海拔因素极大程度地影响着山体土壤细菌的丰富度和多样性。

泰山风景秀丽，是中国五岳之首［7］，被誉为“天下第一山”［8］。泰山山脉东西绵延数百千米，主峰玉皇顶位于泰安城北，海拔1 545 m［9］。泰山是山东丘陵中最高大的山脉，地层结构为盖层风化形成的泰山杂岩［10］，是我国最古老的地层之一。泰山气候垂直变化明显，年降水量随高度增加而增加［11］，泰山多变的地理环境孕育了多种多样的生物。随着泰山旅游业的发展，当地的自然环境发生了改变，这在一定程度上改变了泰山土壤细菌的生存环境。人为因素对泰山环境的干扰问题有待探究和解决。

本试验研究了泰山风景区内海拔260、850、1 500 m的土壤细菌多样性、丰富度及群落结构，分析了海拔因素对泰山土壤细菌群落的影响，可为研究泰山土壤细菌多样性、分析泰山景区的环境扰动因素和探讨生境保护等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 取样

取样地点位于山东省泰安市泰山风景区内，选取样本共3组，分别位于海拔260 m红门周边（T260），海拔850 m中天门周边（T850），海拔1 500 m玉皇顶周边（T1500），每组3个生物学重复。土样均为地表以下10 cm左右，且人为破坏较少处，取样时间为2018年6月28日，取样后立即于-20℃冻存，两个月内完成所有分析工作。

1.2 样品处理

采用Illumina Miseq测序平台，由上海派森诺生物科技股份有限公司对所取样品进行土壤细菌多样性检测。

2 结果与分析

2.1 样本测序数量

本次试验选择的测序数量为40 000条左右，使用QIIME软件［12］对OTU［13］丰度矩阵中每个样本的序列总数在不同深度下随机抽样，以每个深度下抽取到的序列数及其对应的OTU数绘制稀疏曲线（图1）。从图中可以看出，曲线的斜率明显变小，最后趋于平缓，说明各样本检测结果可信度高，可准确反映真实的物种丰富度、多样性和群落特征等指标。

图1 样本的稀疏曲线图

2.2 Alpha多样性分析

Alpha多样性可用来表示每个样本群落的细菌多样性和丰富度。常用指数有Chao1指数［14］、ACE指 数［15］、Shannon指 数［16］和Simpson指数［17］。Chao1指数和ACE指数侧重于体现群落丰富度；Shannon指数和Simpson指数兼顾群落均匀度，均与群落多样性呈正比。为了比较不同样本的Alpha多样性，首先对OTU丰度矩阵中的全体样本统一进行随机重抽样，从而校正测序深度引起的多样性差异；随后，使用QIIME软件分别对每个样本计算多样性指数，分析结果见表1。T260的Simpson指数、Shannon指数、Chao1指数和ACE指数均最大，明显高于T850和T1500，即样本组T260的土壤细菌群落丰富度和多样性最高。T850的Simpson指数和Shannon指数略高于T1500，Chao1指数和ACE指数低于T1500，说明T850比T1500的土壤细菌群落多样性略高，但细菌的丰富度较低。

表1 土壤样本的细菌群落丰富度和多样性指数

2.3 Beta多样性分析

Beta多样性可以考察不同样本之间的群落结构相似性与差异性。本研究通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和非度量多维尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）方法［18］，对样本组的群落数据结构进行自然分解与排序，观测样本之间的差异。通过R软件［19］对属水平的群落组成结构进行PCA分析，以二维图像描述样本间的自然分布特征，结果见图2；对Unweighted和Weighted的UniFrac距离矩阵［20］分别进行NMDS分析，结果见图3。每个点代表一个样本，两点之间的距离越近，表明两个样本之间的细菌群落结构相似度越高。

T260有一个数据（T260.3）异常，分析时排除，其余结果生物学重复性较好。综合分析，T1500和T850两组数据的相似性较高，T260组数据与其他两组数据的差异较大。由此判断，海拔1 500 m和850 m处的细菌群落结构相似度高，海拔260 m处与以上两处的细菌群落结构相似度低。

图2 PCA分析的样本二维排序图

图3 Unweighted UniFrac（A）和Weighted UniFrac（B）NMDS分析的样本二维排序图

2.4 样本菌群组成分析

根据OTU测定结果，可以获得样本组在不同分类学水平上的群落组成情况，结果见图4，门水平上的群落组成情况见图5。由于T260.3在数据上与T260.1和T260.2差别很大，为排除偶然误差影响，所有分析都将T260.3数据排除在外。

在各分类水平上，T260都表现出最多的群落数量，其次是T1500。T260在群落种类方面也表现出与T850和T1500的显著差异。从门水平分析，T260、T850和T1500三组样本中含量最多的均是放线菌门（Actinobacteria），所占比例分别为41.5%、48.4%和50.3%，随着海拔增加所占比例逐渐增多。变形菌门（Proteobacteria）在T260中的含量最高，达到27.4%，在T850和T1500中分别为13.6%和14.8%。蓝藻门（Cyanobacteria）在T260、T850和T1500样本中也占有一定比例，分别为9.4%、8.1%和8.2%。软壁菌门（Tenericutes）在三组样本中差异显著，T850和T1500中的含量分别为18.2%和16.7%，而T260中没有检测到该门类。T260中的异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）占12.0%，而T850和T1500中含量均低于0.2%。拟杆菌门（Bacteroidetes）含量差别也较大，在T260、T850、T1500中占比分别为1.7%、10.9%和9.3%。疣微菌门（Verrucomicrobia）在三组样本中含量不高，具有随着海拔增加逐渐减少的趋势。纤细菌门（Gracilibacteria）在T260未检测到，在T850和T1500中含量很少但比例相似。另外，厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、匿杆菌门（Latescibacteria）、衣原体（Chlamydiae）等均只在T260样本中检测到。总体分析，T260中的细菌门水平上种类最为丰富，T850和T1500的门类比例相似性较大。

图5 样本组门水平上的群落组成和丰度分布

2.5 样本间的OTU聚类分析

利用R软件在97%的相似水平上对T260、T850和T1500的序列进行OTU聚类分析，生成样本组OTU的Venn图（图6）。样本组T260、T850和T1500的平均OTU 数分别是1 958、1 023、1 173；T850的OTU数最少，相对于T260和T1500分别减少了47.8%和12.8%；T260比T1500的OTU数高66.9%。T260、T850和T1500共有的OTU数为184。T260、T850和T1500特有的OTU数分别为1 672、193和283。T260与T850共有的OTU数为205，与T1500共有的OTU数为265；T850和T1500共有的OTU数为809，明显高于两样本组与T260的共有数量。从Venn图分析可知，T850和T1500的群落相似性较高。

图6 基于OTU的Venn图

使用R软件将3组样本属水平上的分类信息进行聚类，绘制热图（图7），热图用颜色变化表示数据多少，将高丰度和低丰度的物种进行分类，红色表示高丰度，绿色表示低丰度，直观地反映了属水平之间相似性和差异性。由图7可以看出，T260相较于T850和T1500，Alicycliphilus、颤蓝细菌属（Oscillatoria）和IIumatobacter等的物种丰度较高。T850相较于T1500和T260，Pseudorhodoferax、无色杆菌属（Achromobacter）和Salinirepens丰度较高。T1500相较于其余两组，不动杆菌属（Acinetobacter）和栖苏打菌属（Nitrincola）的丰度明显较高。不同样本组间的细菌属水平存在明显差异，T260与T850、T1500之间相似度较低，T850与T1500相似度较高。

2.6 菌群代谢功能预测

用菌群代谢功能预测工具PICRUSt［21］，通过将现有的16SrRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物参考基因组数据库做比较，实现对细菌代谢功能的预测；预测过程还考虑了不同物种16SrRNA基因拷贝数的差异。总体而言，3组样本预测出的菌群代谢功能相似，其中，膜转运、氨基酸代谢、碳代谢、复制修复和能量代谢的相关基因丰度较高。T260组菌株的能量代谢、细胞过程、遗传过程和信号转导相关基因丰度较高，T850与T1500的复制修复、转录、核酸代谢相关基因丰度较高。另外，3组样本中都含有较丰富的外源物质生物降解和代谢相关基因，可能与景区人员流动大，带来的环境扰动有关。

图7 结合聚类分析的属水平群落组成热图

3 讨论与结论

本试验采集泰山不同海拔的土壤样本，分析细菌群落之间的异同。低海拔样本组T260相比于高海拔样本组T850和T1500土壤细菌多样性指数和丰富度指数都最高，群落结构也最丰富，这可能与海拔260 m处的土壤细菌所处环境温度较高有关；而高海拔组温度较低、氧气较为稀薄［22］，所以细菌多样性较低。另外，样本组T850的土壤细菌丰富度指数低于T1500，测得的细菌OTU数也较少，这可能与旅游业的发展造成中天门附近土壤细菌环境破坏严重有关。3组样本中都含有较丰富的外源物质生物降解和代谢相关基因，分析可能跟景区人员流动大，带来的环境扰动相关。人为因素给泰山不同海拔土壤细菌多样性和丰富度带来了或多或少的影响，造成了部分细菌群落多样性发生改变，因此环境修复问题应受关注。