基因组DNA羟甲基电致化学发光生物传感研究进展

张银冰

摘  要：电致化学发光分析法兼有电化学和化学发光分析法的双重优势，具有灵敏度高、线性范围宽、反应可控性强、背景干扰小、选择性好和仪器简单等优点，己经被广泛应用于生物分子的检测以及疾病的诊断等方面。生物传感器是由生物识别元件和物理化学信号传感系统组成的分析设备，可方便地进行生物分析检测。本论文对基因组DNA羟甲基电致化学发光生物传感研究进展现状，进行了综述。

关键词：基因组;DNA羟甲基化;电化学发光;生物传感器

电化学发光（Electrochemiluminescence），它不但有着英文缩写名称，还有另外一个名为电致化学发光（Electrogeneratedchemiluminescence）名称。ECL是将电压以及电流经过电极施加到化学发光物质上促进某种新物质的衍生，该物质和发光物质会产生反应，供应充足的能量来改变发光物质的状态，让其从原本的基态变成了后来的激发态，在重新回到基态，经过这样的改变，给发光供应足够的能量;亦或是将电压以及电流经过电极的方式供应能量，让发光物质可以产生氧化还原反应，让中间态物质在不稳定的状态下出现分解，供应能量促使发光。[1]所以，利用酶切来删掉甲基基团，这是不可缺少的。这一点也是生物学家最关注的问题。人体内的细胞有时为了再次分化，或许会对已经分化后的细胞再一次进行分化，一直分化到最低的状态为止，这个过程就是删除甲基化的环节，分析这个过程，对于医疗运用来说有着难以言喻的价值。

1DNA羟甲基化

1948年人们第一次从人类DNA中识别出了被称为DNA“第五个碱基”的5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在真核生物中，DNA甲基化是在C-5位的胞嘧啶环上添加一个甲基后形成的。这个过程是在被称为“CpG岛”的y-CG-3^？列中经DNA甲基转移酶催化后发生的。5-mC是最常见的真核生物DNA修饰，也是许多表观遗传（只改变基因表达，而不改变核苷酸序列）现象的一种。[2]虽然甲基化DNA在植物和哺乳动物中分布广泛，但在一些真核生物，比如果蝇和酿酒酵母中并未检测到甲基化DNA^-84〗。于是，人们开始怀疑其在正常发育和特异性基因表达中的重要性。然而，最近的研宂表明，在敲除转基因小鼠中对DNA甲基化起重要作用的DNA甲基转移酶基因后，小鼠发育异常和胚胎致死的表达水平仍然下降，这就消除了人们之前的怀疑。[3]

DNA甲基化整体调控中的一个关键步骤是DNA去甲基化。用甲基敏感性内切酶监测DNA甲基化水平后发现，在胚胎发育过程中，移植前的胚胎甲基化水平很低之后许多CPG岛残基发生再甲基化，但在移植时，剩余的CpG岛并未发生甲基化。胚胎植入后，许多DNA被甲基化，而组织特异性（Tissue-specific）基因在其相应的表达组织中却发生去甲基化。因此，对于生物的整个基因组DNA来甲基化模式是表观遗传信息的重要组成部分，是区分细胞的重要标记物。5-甲基胞嘧啶（5-mC）通常被认为是DNA的“第五个碱基”。在受精和胚胎发育后，大量输甲基化标记物被删除这使得胚胎干细胞能分化成任何可能的专职细胞。在某些情况下，DNA的去甲基化发生时没有细胞分裂，也就没有合成新的DNA。因此，甲基基团必须通过酶切主动地去除。主动去甲基化机制是人们最感兴趣的，因为一些细胞为了重新分化，有可能主动进行DNA去甲基化换句话说，将己经分化的细胞进行再分化，转变为更低分化状态的过程，就是主动去甲基化，这在医疗应用方面由很大的研究价值。说，肯定存在一种去除DNA中甲基胞嘧啶的方式。

2电致化学发光

最近几年，由于电化学发光检测技术的优势不断的显露，人们开始重视电化学发光检测方式的运用，比如，其有着较高的灵敏性，操作流程简单、反应迅速、节省试剂等。这些都是电化学发光检测技术最显著的优点，它的出现促进了生物分析的发展，大大的提升了检测生物分子的效率和质量，并且日渐普遍。一直以来，生物学家都在寻找研究DNA去甲基转移酶活性的问题，也有不少的生物学家来不断的检测羟甲基化DNA，自从电化学发光检测技术衍生后，生物学家找到来一个合适的分析和检测平台。

电致化学发光（ECL）分析法无论是从电化学的角度来说亦或是从化学发光分析法的角度来说，都是有着显著的优势的，它有着较高的灵敏性，反应快，范围广，干扰性低，好选择以及操作便利等等，这些都对研究有着很大的帮助。如今，电致化学发光（ECL）分析法在医疗领域开始普遍使用，其中运用最多的就是检测生物分子，诊断患者的病情等等，可是学者对ECL分析法分析的成果不多，特别是检测5-hmC更是少之又少。

3电化学发光DNA生物传感器

生物传感中的传感系统涉及各种检测器，如压电，光学，电化学，电化学发光等。生物传感方法近几十年来蓬勃发展，为临床早期诊断带来了重大突破。商业化和临床应用的生物传感器应该具有稳定、快速、高灵敏和廉价的特点。在对生物传感有贡献的技术中，电化学发光由于具有电势可控和灵敏度高的双重优势，引起了人们的广泛关注。电化学发光生物传感是将特异性识别物质如抗体、酶、DNA等固定在电极上而组成的分析元件，通过目标分析物结合前后电化学发光强度的变化来进行定量检测，广泛应用于生物分析，免疫分析，食品安全和环境监测等。其中，DNA是生物體遗传信息的主要载体，引导生物发育与生命机能运作，电化学发光DNA生物传感器结合了生物识别的特异性及ECL的高灵敏性，为DNA分析提供了一种很有前景的方法，越来越多的研究者致力于电化学发光DNA生物传感的研究。

许多DNA检测体系基于目标DNA与其互补探针的杂交，Li等报道了一种电化学发光生物传感方法检测DNA甲基化，该方法结合酶联反应实现了对DNA甲基化水平的高灵敏检测。[5]然而，该方法需要对目标分析物进行标记，使得分析过程比较复杂。Zhang等使用发夹DNA作为识别元件，以钌复合物作为信号物质，构建了一种用于检测靶单链DNA（ss-DNA）的高选择性ECL生物传感器。该ECL方法具有较高的灵敏度和很好的选择性，并且不需要对目标分析物进行记。[6]

结束语

电化学发光分析法结合了发光分析高灵敏度和电化学电位可控等优点，引起了诸多分析化学工作者的关注。电化学发光生物传感器是将特异性分子识别物质如酶、抗体或DNA等生物分子作为分子识别物质固定在换能器上，以电化学发光信号为检测信号的分析器件，其具有灵敏度髙、线性范围宽、反应可控性强、成本低廉、分析速度快、操作简单和易于微型化与集成化等优点，己经被用于一些疾病相关的生物标志物检测。但是目前一些低水平的生物标志物检测仍然是电化学发光生物传感器面临的一大挑战。近年来，具有优异性质的不同结构、组成和形貌的纳米材料的引入促进了电化学发光生物传感器的发展，大大提髙了其检测的灵敏度和选择性。

参考文献

[1]  马鼻肺炎病毒进化分析及DNA条形码的确定[J].郑小龙，王群，孙明君，孙涛，朱来华，梁成珠，岳志芹.中国兽医学报.2017（02）

[2]  DNA步行者分子机器研究新进展[J].汪晶，王东霞，马嘉懿，孔德明.中国科学：化学.2019（05）

[3]  1种简单有效的根际土壤微生物DNA提取方法[J].郑道君，张冬明，吉清妹，史珍萍，符传良.江苏农业科学.2017（04）

[4]  DNA：FromCarrierofGeneticInformationtoPolymericMaterials[J].JiaojiaoZhang，FengLi，DayongYang.TransactionsofTianjinUniversity.2019（04）

[5]  超声波细胞粉碎机在高通量测序片段化DNA中的应用[J].李根亮，卢舒雨，许苡侥，黄捷，黄晓敏，肖娟，农嵩.右江民族医学院学报.2016（05）

[6]  DNA双螺旋结构探寻路上竞争中的合作[J].张翮.自然辩证法通讯.2017（03）

基金项目：国家自然科学基金项目（No.21575109）