细胞治疗产品（CAR-T）GPM车间设计

摘 要：CAR-T疗法就是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，本文介绍了其生产的工艺流程及车间设计的要点。

关键词：细胞治疗产品;车间设计

近年来，免疫治疗经历了一系列突飞猛进的发展，以特异性过继免疫细胞疗法及免疫检查点抗体疗法为代表的新型免疫治疗技术因其在临床研究中取得的显著疗效而成为学术界和产业界共同关注的焦点。随着我国对CAR-T技术的研究不断深入，国内企业的积极布局和产业链的延伸，我国的CAR-T细胞治疗技术也在紧随国际趋势的发展。为了适应我国CAR-T细胞治疗产业的需要，加强CAR-T细胞治疗的质量管理，国家出台了相应的规范及技术指导原则，笔者结合项目实际案例，针对此类厂房的设计要点进行研究。

1 CAR-T（细胞治疗）产品的特点

CAR-T生产工艺复杂、要求高。CAR-T疗法不同于传统药物，是一种基于整合了CAR基因的自体T细胞疗法。这意味着CAR-T必须在尽可能短的时间内完成抽血、分离、激活、转染、扩增、制剂、放行、冻干、运输和给药。其生产的特点是：（1）产品个性化很强，需要模块化生产;（2）单个产品规模小，但是操作复杂;（3）生产全过程需要无菌控制，同时防止不同产品之间的交叉污染。

2 总体设计思路

结合CAR-T（细胞治疗）产品的特点，在进行工厂设计时一般包括生产单元、储存单元、质控检测单元等，CMO公司还会有技术转移单元。其中核心的生产单元包括产品的制备区和病毒、质粒载体区，但是随着工艺的更新，非载体的细胞治疗产品越来越多，安全性越来越高，很多厂家只保留了核心的细胞产品制备区。细胞治疗产品、病毒载体和质粒的生产应当分别在各自独立的生产区域进行，并配备独立的空调净化系统。

3 CAR-T细胞终产品制备工艺流程

（1）采集接收外周血。

（2）操作前准备：从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。

（3）分离单个核细胞（PBMC）：使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入离心管中。用缓冲液按比例稀释外周血，混匀。

（4）将稀释好的血样缓慢加入室温的人淋巴细胞分离液的离心管中离心。离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，稀释，混匀。

（5）离心，重悬细胞混匀，取少量细胞计数。离心，上清液送检无菌检测。

（6）细胞培养：在一定温湿度及CO2浓度条件下，进行细胞培养。定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。根据细胞状态和临床治疗需要，培养至细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。

（7）5Car-T细胞收集：确认细胞各项检测己符合要求。根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。细胞悬液转入离心管中，离心。除去上清培养液，加缓冲液稀释混匀，离心，弃上清。

（8）细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。

（9）细胞运输与保存：核对细胞标签内容，填写回输发放记录。细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。

4 车间工艺平面设计

总体分为辅助区生产区、动力区、核心生产区、质检区（如下图）：

核心生产区包括样本登记预处理区、细胞制备区、试剂配制区、成品冻存区、废弃物处理区。

辅助生产区主要为核心生产区B级区提供辅助功能，包括B级区人员更衣通道，一次物料的传递，环境清洁与消毒所需的试剂配制，B级区洁净服的清洗与灭菌等。辅助生产区的洁净级别设置为C级。

动力区主要包含空调系统，气瓶间，纯化水系统，配电系统。

质检区主要是CAR-T的放行检测，包括生化检測、微生物检测、细胞学检测。生化检测实验室主要使用了PCR仪等设备，用于CAR-T的鉴别和纯度检测。

5 人物流设计

人员通过车间西北侧楼梯进入二层，在二层设置人员更鞋、总更衣，人员经总更后，进入细胞与基因治疗研究中心，一般生产区人员直接进入一般生产区各生产岗位;洁净区人员需再经过换鞋脱外衣、洗手、穿洁净衣、手消毒等方可进入生产区，疏散设置相应的安全门。

物流途径：原辅料和包材通过一层车间东北部的电梯运输到二层细胞与基因治疗研究中心，通过缓冲间进入净化车间，成品再通过车间东北部的电梯运输出去。

6 空调系统设计

空调系统一共分为三个系统：普通生产区（CNC）、辅助生产区（C级）、核心生产区（B级）。洁净区一般设计温度18℃～26℃，相对湿度45%～65%。相邻的不同洁净级别的房间的压差应保持在15Pa（门关的状态）。有洁净级别的房间与室外的压差应大于等于15Pa。相同洁净等级的房间将在相对洁净的房间到其它房间维持5Pa的正压，以保证污染从相对洁净的房间到相对非洁净的房间。空气处理方式：新风与回风经空调箱初效，中效过滤后，经高效送风口送入室内。B级区采取CAV、VAV方式稳定控制压差。气流组织为：洁净区为上送下侧回，CNC区为上送上回。

7 公用工程系统设计

公用工程系统主要包含洁净公用工程系统和非公用工程系统。CAR-T产品的生产主要采用一次性技术，所以洁净公用工程系统相对简单，包含纯化水系统、纯蒸汽系统、CO2系统。

（1）纯化水系统主要用于洁净服的清洗、辅助生产区的器具、洁具的清洗、操作人員洗手。

（2）纯蒸汽系统主要用于核心生产区（B级）的工作服的灭菌。

（3）CO2系统主要用于细胞培养使用，使用外部采购气瓶，放置在洁净区外面的气瓶间，通过管路输送至工位上使用。

非洁净公用工程系统主要包含空调冷水系统，蒸汽系统，压缩空气系统，配电系统。

（1）空调冷水系统，蒸汽系统主要为洁净空调系统提供冷热源，控制洁净区的温度和湿度。

（2）压缩空气系统主要用于部分气动阀门的动力。

8 设计重点分析

（1）如果细胞分离，培养扩增，分装等操作在一个房间进行，则同时只能生产一个批次的产品，所有的操作应当在生物安全柜中进行;如果采用隔离器操作以及全自动密闭设备生产，环境等级可以适当降低到C级。

（2）当核心生产区设置为B级时，由于CAR-T产品的生产主要采用一次性技术，所以大部分耗材，试剂通过辅助生产区，采用VHP（过氧化氢）对内包材进行灭菌后传入B级区，样品包装表面由于无法通过VHP以及高温消杀，只能通过化学消毒剂进行消杀，其效果必须经过验证。

（3）核心生产区大多采用生物安全柜操作，由于房间面积不大，需要对压差进行动态控制，防止不同工况下压差波动巨大。常规通过变风量系统进行自动调节。

（4）核心操作区内的废液，与细胞直接接触的一次性耗材，都需要在核心区内灭活后方可拿出核心区。

9 结语

目前随着CAR-T技术的运用及发展，CAR-T生产工艺也在一直不断更新，生产工艺朝着高度自动化，模块化方向发展。在具体工程设计时，要结合具体的工艺路线进行设计，在设计上杜绝不同病例产品之前的交叉污染，同时兼顾产品工艺变化的灵活性。

参考文献：

[1]陈国笋.细胞治疗产品的工艺平面与厂房设施的设计.上海医药，2019（9）.

[2]中华人民共和国卫生部令第79号.药品生产质量管理规范[4]（2010年修订）[S].

作者简介：陈方超（1985-），男，汉族，江苏南京人，本科，工程师，目前从事制药工程工艺设计。