应用顺铂联合长春瑞滨后常规二维超声、ARFI以及病理对照综合评价对家兔肝损害的实验研究

吴珊珊 李鹏 栗雯霏 龙小雪 栗建辉

1河北大学附属医院超声科,保定071000；2河北省人民医院超声科,石家庄050051

据2018年的统计数据显示,肺癌是我国男性发病率和病死率均为第一位的癌症,也是我国女性发病率第二、病死率第一的癌症[1],其中非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)占多数。手术治疗以及术后化疗已成为肺癌的主要治疗手段,但有部分患者经过几个化疗周期后在超声复检时出现肝脏形态饱满,实质回声致密增强,肝后部不同程度回声衰减,类似脂肪肝的超声图像表现,有学者认为是化疗性脂肪肝[2],而脂肪肝病变严重者可影响肝脏功能,可发展成为脂肪性肝炎、肝纤维化,继而肝硬化,甚至导致整个化疗方案的失败。为了探究这一现象的原因,尽早干预,本研究根据NSCLC常用化疗药方案进行了兔肝动物实验,并联合多种数据对比,探讨化疗后肝脏损害的情况,尤其是对脂肪变性的病理改变进行评价,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只健康雄性新西兰白兔 [北京兴隆实验动物养殖场提供,生产许可证号SCXK(京)2016-0003],体质量 (2.1±0.10)kg,应用简单随机法将兔分为A、B、C组,每组10只。在恒温饲养室[温度 (20±3)℃,湿度 (55±5)%]单笼喂养1周,以适应实验环境。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2 实验方法 A 组给予普通饲料+淀粉,B 组给予化疗药(顺铂1.5 mg/kg+长春瑞滨2.2 mg/kg)及普通饲料喂养,C 组给予化疗药 (顺铂1.5 mg/kg+长春瑞滨2.2 mg/kg)及高脂饲料喂养。B组和C组家兔每3周兔耳缘静脉给予化疗药1次,连续6个周期。每组兔均于实验前、实验结束时抽耳缘静脉血查血清总胆固醇 (total cholesterol,TC)、甘油三酯 (triglyceride,TG)、丙氨酸氨基转移酶 (alanine aminotransferase,ALT)、 天冬氨酸氨基转移酶 (aspartate aminotransferase,AST),同时行肝脏常规超声检查及肝实质声辐射力脉冲成像 (acoustic radiation force impulse imaging,ARFI)测定,即剪切波速度值测量。实验结束时腹腔注射氨基甲酸乙酯处死家兔,剖腹取肝脏,福尔马林溶液固定,由2名病理科高年资主任医师观察切片,观察结果与肝脏声像图进行对照研究。

1.3 超声检查 应用德国Siemens S2000彩超仪,选择高频 (4.0～9.0 MHz)线阵探头扫查,探查深度5.0 cm。实验兔腹部去毛后使其仰卧,首先观察兔肝的大小、形态、包膜光滑度、内部实质回声情况、肝内外管道走行、管径变化及管壁回声强度等情况,然后启动ARFI钮,在右肋间门脉长轴切面距体表1.5 cm 处,避开肝内管道系统测量肝实质的剪切波速度值。随机取3个等深点测量,每个等深点测3次,取9个数值平均后进行统计学处理。

1.4 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件处理数据。计量资料以±s 表示,采用配对t 检验、F检验和SNK-q 检验进行比较。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 用药前后肝功能比较 A 组用药前后AST和ALT 差异均无统计学意义,B组和C 组用药后AST 和ALT 均较用药前升高 (P 值均＜0.05);用药后B 组和C 组AST 和ALT 均高于A 组,C组AST 和ALT 高于B 组,差异均有统计学意义(F =1 204.517、5 695.501,P 值均＜0.001)。见表1。

2.2 用药前后血脂比较 A 组和B 组用药前后TC、TG 差异均无统计学意义,C 组用药后TC、TG 均较用药前升高(t=441.536、10.506,P 值均＜0.05),用药后C组TC、TG 均高于A 组和B组(F =122 890.902,75.943,P 值均＜0.001)。见表2。

2.3 超声表现 A 组应用普通饲料及淀粉后超声未见异常;B组应用化疗药后肝脏常规超声显示肝包膜稍增厚,体积无明显变化,肝实质回声不同程度增强,回声不均匀,胆管壁及门脉壁回声增强(图1);C 组肝体积稍大,内部回声情况同B 组,还可见肝实质回声稍致密增强,类似轻度脂肪肝的表现(图2)。A 组用药前后ARFI测定值差异无统计学意义,B组和C组用药后ARFI测定值均较用药前增加 (t =18.30、23.92,P 值均＜0.001),用药后B 组和C 组ARFI测定值均高于A 组,C 组 ARFI 测定值高于B 组 (F =159.103,P ＜0.001),见表3。

表1 3组兔用药前后天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶比较 (±s,U/L)

表1 3组兔用药前后天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶比较 (±s,U/L)

注：A组为对照组;B组为化疗组;C组为化疗+高脂饲料组;与A 组比较,a P ＜0.05;与B组比较,b P ＜0.05;与用药前比较,c P ＜0.001

组别只数天冬氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶用药前用药后用药前用药后A 组10 26.88±4.19 29.38±2.87 31.83±1.42 30.92±1.47 B组10 28.75±4.20 69.69±3.39ac 33.81±4.81 71.12±1.07ac C组10 26.91±2.45 101.35±3.56abc 29.49±1.28 94.21±2.88abc F 值0.833 1 204.517 0.348 5 695.501 P 值0.446＜0.001 0.709＜0.001

表2 3组兔用药前后总胆固醇和甘油三酯比较 (±s,U/L)

表2 3组兔用药前后总胆固醇和甘油三酯比较 (±s,U/L)

注：A组为对照组;B组为化疗组;C组为化疗+高脂饲料组;与A 组比较,a P ＜0.05;与B组比较,b P ＜0.05;与用药前比较,c P ＜0.001

组别只数总胆固醇甘油三酯用药前用药后用药前用药后A 组10 1.69±0.33 1.90±0.45 1.33±0.43 1.42±0.32 B组10 1.97±0.25 2.00±0.37 1.31±0.33 1.30±0.32 C组10 1.65±0.34 99.26±0.65abc 1.36±0.29 3.07±0.43abc F 值3.113 122 890.902 0.057 75.943 P 值0.061＜0.001 0.945＜0.001

2.4 用药后病理检查结果 A 组用药前后无明显异常。B组可见肝细胞水肿,轻微散在脂肪变性,汇管区炎细胞浸润,部分炎细胞浸润血管壁和胆管壁,少许淤血及淤胆,点状坏死及少许纤维化(图3)。C组除有B 组病理损害外,还显示体积稍大,出现较多大泡型和小泡型脂肪变性及少许轻度再生结节(图4)。

图1 化疗组兔超声显示肝包膜稍增厚,肝实质回声不同程度增强,回声不均匀,胆管壁及门脉壁回声增强

图2 化疗+高脂饲料组兔超声显示肝体积稍增大,实质回声增强,不均匀,略致密,胆管壁及门脉壁回声增强

表3 3组兔用药前后声辐射力脉冲成像测定值比较 (±s,m/s)

表3 3组兔用药前后声辐射力脉冲成像测定值比较 (±s,m/s)

注：A 组为对照组;B 组为化疗组;C 组为化疗+高脂饲料组;与A 组比较,a P ＜0.05;与B 组比较,b P ＜0.05;与用药前比较,c P ＜0.001

组别只数用药前用药后A 组10 0.93±0.03 0.94±0.58 B组10 0.95±0.03 1.20±0.06ac C组10 0.95±0.04 1.50±0.09abc F 值1.867 159.103 P 值0.174＜0.001

3 讨论

肺癌是目前全球发病率和病死率最高的癌症之一[3],其中NSCLC (鳞癌、腺癌及大细胞癌)占80%～85%,其早期症状无明显特异性,多数患者在就诊时已处于中晚期,临床治疗以手术+术后辅助化疗或化疗为主。多年来,专家指南均推荐含铂两药为治疗NSCLC的一线化疗方案,其中顺铂疗效肯定,长春瑞滨与顺铂具有协同作用,二者合用成为治疗NSCLC 最常见且疗效确切的经典方案,在临床上应用广泛[4]。本实验用顺铂联合长春瑞滨给家兔进行6个周期注射,观察化疗后造成肝损害的病理所见,尤其注意脂肪性肝损害的情况。临床上经常观察到,有一部分肿瘤患者应用几个周期的化疗药后在超声检查时出现肝实质回声增强、不均匀、后方回声衰减等类似脂肪肝的超声表现,这种表现是否由于化疗药引起,故做本实验加以证实。

图3 化疗组兔6个月后肝病理表现 HE ×400 A：肝小叶部损害;B：肝汇管区损害

图4 化疗+高脂饲料组兔6个月后肝病理表现 HE A：肝脂肪变性 ×200;B：肝再生结节及脂肪变性 ×100

大多数化疗药除了引起胃肠道反应、骨髓抑制、肾毒性等不良反应外,均可引起肝脏损害。这主要是因为化疗药一般都在肝脏代谢,除了药物本身成分的毒性损害外,药物代谢产物也可引起肝脏损害。多名中外学者应用顺铂对小鼠(大鼠)所做的实验显示,肝转氨酶有不同程度升高,超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶降低,丙二醛升高,肝组织出现肝细胞水肿、空化,中央静脉扩张、淤血、静脉周围窦扩张,点片状炎性细胞浸润和坏死等,同时给予丹参或牛樟芝溶液灌胃可减轻顺铂对肝脏的损害[5-7]。叶冬梅等[8]将长春瑞滨注射于小鼠尾静脉内,给药第3天即出现肝细胞损害,50%为中到大量脂肪变性,20%出现点状肝细胞坏死,坏死灶周围有炎性细胞浸润,12.5%出现瘀胆,AST、碱性磷酸酶、直接胆红素较对照组明显升高;肝组织丙二醛较对照组明显升高,还原型谷胱甘肽则显著降低,表明肝损害与氧化应激有关。张彩霞等[9]应用长春瑞滨对Beagle犬进行了肝、肾毒性实验,其中AST、ALT、总胆红素、总蛋白及白蛋白有剂量依赖性降低,肝组织有较多脂肪空泡及汇管区轻度炎细胞浸润。本研究B组、C组肝功能指标有不同程度升高,表明化疗药产生了一定的肝损害;C组TC和TG 有明显升高,表明引起了血脂异常,可能是高脂饲料引起高血脂造成的。有学者研究显示,化疗药可引起血脂增高,且血脂增高的患者更容易造成肝功能损害[10]。本研究表明B 组虽然没有引起血脂增高,但病理上造成轻微散在脂肪变性,而C 组不但血脂增高,且肝功指标还高于B 组,病理上出现了更为高级别损害的再生结节,提示血脂增高容易引起肝功能异常或加重肝功能损害。上述肝损害的机制可能与下述原因有关：(1)血脂增高后肝脏不能及时转运脂肪组织,使其过多沉积于肝脏造成脂肪肝,进而影响肝功能,肝细胞受损,导致结缔组织增生和肝纤维化,甚至硬化[11]。 (2)大多数化疗药具有细胞毒性和免疫抑制性,可直接引起肝损害[12]。脂质代谢异常患者常伴有慢性肝损害,导致药物代谢能力下降,药物本身及代谢产物进一步加重肝损害。(3)促炎细胞因子加剧肝损害。化疗后肿瘤可释放肿瘤坏死因子,可引起肝损害甚至肝细胞坏死[13]。(4)氧化应激反应。过多的游离脂肪酸引起肝细胞线粒体内氧化过度,产生大量活性氧,解偶联蛋白2代偿性增多,以便减少活性氧的产生,结果三磷酸腺苷大量消耗,导致肝细胞凋亡或坏死[14]。肝细胞坏死产生大量炎性因子,进而又促进自由基产生过多,造成肝细胞损害。

本实验超声方面B 组应用化疗药后肝脏常规超声显示肝包膜稍增厚,肝实质回声不同程度增强,回声不均匀,胆管壁及门脉壁回声增强,这可能是由于肝产生病理损害后,细胞水肿,脂肪变性,汇管区、血管壁及胆管壁炎细胞浸润,点片状坏死及局限性纤维化,甚至再生结节出现,致使肝组织结构紊乱,产生杂乱的超声界面,从而出现上述异常超声表现。而C 组除了化疗药,还增加了高脂饲料,在B 组病理基础上出现较多大泡型及小泡型脂肪变性,使肝组织脂肪浸润较多,从而造成肝体积稍大;内部回声除了B 组的表现外,还可见肝实质回声稍致密增强,类似轻度脂肪肝的表现。

ARFI是新近研究出来的一种评价弹性 (硬度)的非侵入性检查技术,探头通过瞬时声辐射力发出短脉冲并产生剪切波,使被检测部位产生位移,并得到一个定量的剪切波回波,通过这个定量剪切波速度的测量就可确定被检测部位组织结构的弹性(硬度),硬度越大则剪切波速度越快,硬度越小则相反[15]。ARFI 是评价实质组织器官病变[16]及非酒精性脂肪肝纤维化损害较为准确的非侵入技术之一[17]。本研究B组、C组用药后ARFI测定值增高也是由于肝脏受损后 (尤其是纤维化、再生结节形成),肝脏组织结构失去原来柔软均质的特性,致使肝实质轻度变硬,导致剪切波速度增快。

临床上化疗后超声复检时经常发现患者肝脏类似脂肪肝样改变,而脂肪肝严重可导致脂肪性肝炎,甚至纤维化、硬化,使整个化疗失败。有学者认为化疗药可直接作用于肝细胞,使其坏死,促使细胞色素P450酶的激活,激活后的代谢产物可充当氧化剂长时间作用于肝脏,使其脂肪代谢能力下降,最终造成化疗性脂肪肝[18]。目前,临床上诊断脂肪肝的“金标准”依然是肝穿刺活检的病理学诊断[19],但因其具有创伤性,不能作为常规方法。临床上诊断脂肪肝的首选无创方法是超声,其对脂肪变性的诊断效果具有60% ～94% 敏感度和66%～97%特异度,但对于脂肪变程度＜30%的病例则难以检出[20]。此外还有血清指标 (包括ALT、AST、TC及TG 等)、CT、MRI等检查方法,但CT 有放射性损害,MRI价格昂贵,不适于临床首选。

综上所述,本动物实验应用顺铂联合长春瑞滨6个周期后,化疗药对肝脏可以造成类似肝炎的不同程度损害,但B 组在病理上肝脏脂肪变并不明显,在超声上未显示出脂肪肝的声像图表现,而C组病理上除了有B 组的损害外,还出现了较多大泡型及小泡型脂肪变性,在超声上也呈现了轻度脂肪肝的声像图表现。据此认为,临床上化疗患者出现的脂肪肝超声图像改变很大程度上可能是由于营养过剩所致,因在化疗过程中或之后,患者常遵医嘱加强饮食营养,进食较多高能量食物,而造成脂质在肝组织内沉积,最终形成脂肪肝。ARFI对于化疗后肝损害评价有一定价值,值得在临床上推广。

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