辽藁本内生细菌ZHAB63鉴定与拮抗菌筛选

张芳芳，田义新*，卢宝慧，王志清，刘桂英

（1.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2.白山市江源区农业农村局，吉林 白山 134700）

随着中药材市场需求扩大，东北地区道地药材如人参、细辛、刺五加、防风、苍术等人工栽培模式不断完善，但植物病害成为阻碍中药材健康生长的关键因素。化学农药易产生环境污染，生物农药以其低毒高效无残留且使用方便等优点备受关注，利用植物内生细菌开发生物农药成为药用植物病害防治研究热点[1-2]，植物内生细菌长期存活于健康植物组织内部，可与宿主植物共生而不致其表现明显病害症状[3]。

自20世纪90年代，Wei等首次提出“内生细菌”概念后[4]，现已分离鉴定内生细菌多达50余属120余种[5-6]。其中，解淀粉芽孢杆菌可用于多种植物病害防治，效果较好[7-8]。植物内生细菌作为一种宝贵资源，应用前景广阔[9]，但大部分植物组织中内生细菌资源未被分离，仍处于空白阶段，亟待深入研究。

辽藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitag）是伞形科藁本属草本植物，以干燥的根及根茎入药，味辛，性温，具有祛风、散寒、止痛等功效[10]。主要分布在吉林、辽宁、河北等省，是我国东北地区常见道地药材之一[11]。具有一定疗效及药用价值，但目前有关辽藁本研究主要集中于化学成分及生理生化方面[12-13]，辽藁本内生细菌研究尚未见相关报道。

本研究以东北地区道地药材辽藁本为试验材料，首次开展内生细菌相关研究，从辽藁本2个吉林主产区长春、通化采集根及根茎部组织，分离内生细菌，筛选高效抑制植物病原真菌内生细菌，选取一株分离自辽藁本根部并表现较强拮抗作用ZHAB63菌株，对其作分子鉴定，优化培养基及发酵条件，旨在填补东北道地药材辽藁本内生细菌研究领域空白，发掘广谱性内生细菌作为生物制剂开发原料，为辽藁本内生细菌开发利用及生物防治新途径探索提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

健康辽藁本植株分别于2018年6月采自吉林农业大学药用植物示范园、吉林省通化县富江乡富裕村种植基地，经鉴定均为伞形科植物辽藁本（L.jeholense）。

1.1.2 供试病原菌

本研究所用人参病原菌由吉林农业大学植物保护学院提供，其他植物病原菌均由吉林农业大学中药材学院提供。具体见表1。

表1 供试指示菌株Table 1 Tested indicator microbe

1.1.3 供试培养基

病原真菌由马铃薯葡萄糖（Potato dextrose agar）培养基保存[14]：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、无菌水1 000 mL；内生细菌纯化、培养为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NACl 5 g、琼脂粉20 g、无菌水1 000 mL、pH 7.4～7.6；牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、无菌水1 000 mL。培养基灭菌条件均为1×105Pa灭菌30 min。

1.2 内生细菌分离和纯化

将新鲜辽藁样本于流水下冲洗，除去表面泥沙及杂物，无菌纸吸干表面附水，挑选完好根及根茎切成约1.5 cm小段，先用75%乙醇试剂漂洗1 min，无菌水冲洗5次，再依次浸入0.1%HgCl2消毒试剂处理，无菌水冲洗5次。接入牛肉膏蛋白胨培养基28℃暗培养，15 d无污染后，除去外表皮，切成约0.5 cm小段，再接入新牛肉膏蛋白胨培养基中，每皿接入6个样品，重复3次，28℃暗培养。取最后1次用于表面清洗的无菌水涂布在培养基平板上作为对照组，置于相同环境下，检验消毒效果。对照组若无菌落生长，表明辽藁本表面消毒彻底，同时获得辽藁本内生细菌。划线法纯化多次至单一菌种后，转接至新牛肉膏蛋白胨培养基斜面并编号，于4℃冰箱保存备用。

1.3 内生细菌拮抗活性检测

首先采用生长速率法初筛，即在90 mm培养皿中倒入10 mL牛肉膏蛋白胨培养基，待温度40℃左右每个培养皿倒入1 mL待测内生细菌菌株发酵液（取一环菌体接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，250 mL三角瓶装液量为50 mL，28℃恒温振荡培养，180 r·min-1摇菌2 d），混匀。待培养基凝固后，在中央放置直径6 mm供试植物病原菌菌饼，28℃暗培养，每日定时观察培养基中菌株生长状况及是否具有抑菌作用，将有拮抗效果菌株4℃斜面保存备用，准备复筛。复筛同样利用生长速率法（方法同初筛），对照组则以1 mL蒸馏水替代内生细菌发酵液混匀于培养基，当对照组病原菌菌落直径超过40 mm时，十字交叉法测量。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

1.4 菌株ZHAB63鉴定

1.4.1 形态特征观察

将待测菌株ZHAB63在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线，28℃培养48 h，观察记录菌落形态、颜色、透明度、干湿度等特征；采用革兰氏染色法判断是否为革兰氏阳性菌。

1.4.2 分子鉴定

取一环ZHAB63菌体接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基（250 mL三角瓶装液量为50 mL），于28℃恒温、180 r·min-1摇床中培养15 h，使菌液OD值为1～2，按照离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取ZHAB63内生菌株DNA，经2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA是否提取成功。对其16SrDNA基因片段作PCR扩增。引物由上海生物工程股份有限公司合成。序列如下：

正向引物27f：5'AGAGTTTGATCCTGGCTC AG 3'

反向引物1492r：5'GGTTACCTTGTTACGAC TT 3'

PCR扩增体系为：Template（DNA模板）5 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL，27f和1492r引物均2.5 μL，加ddH2O 15 μL，使扩增体系达50 μL。

PCR循环条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s（35个循环），55℃退火1 min（35个循环），72℃延伸90 s（35个循环），72℃修复延伸10 min，4℃复性（无限循环）直至终止反应，

PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序所得拼接序列用NCBI中Blast检索，在核酸数据库中比对分析相近序列，MEGA7.0软件分析，以Neigh⁃bor-joining方法构建系统发育树，使用Bootstrap（1 000次重复）检验，作亲缘关系及系统发育分析。

1.5 拮抗菌ZHAB63发酵条件优化

1.5.1 正交试验

以牛肉膏蛋白胨培养基为对照，采用单因素试验法分别研究不同碳源（葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉）、不同氮源（蛋白胨，酵母粉，氯化铵，硝酸铵）、不同无机盐（氯化钠，氯化钙，硫酸锌，硫酸铜，硫酸镁）在其他条件不变情况下，测定ZHAB63菌株对细辛菌核病菌抑菌率，结合试验结果及文献资料，选择液体发酵培养基主要组成成分（A-蔗糖、B-酵母粉、C-蛋白胨、D-硫酸镁）作正交试验，见表2，以确定最佳配方。

表2 L9（34）正交试验因素水平Table 2 L9 （34） orthogonal test factor level table

1.5.2 培养条件优化

基于优化的培养基，取分离纯化后保存的内生细菌ZHAB63，对培养时间、培养温度、转速和pH作单因素条件优化，检测菌株在不同培养条件下获得发酵液抑菌效果。培养时间：设置12、24、36、48、60、72、84 h 7个时间点，在pH为7，28℃、180 r·min-1培养条件下，测定抑菌率，确定最佳培养时间；培养温度：设置26、27、28、29、30、31、32 ℃，在pH为7，180 r·min-1培养48 h，测定抑菌率，确定最适培养温度；转速：设置 160、170、180、190、200、210、220 r·min-1，在pH为7，28℃培养48 h后，测定抑菌率，确定最佳转速；pH：设置5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28 ℃、180 r·min-1培养48 h，测定抑菌率，确定最适pH。每组3次重复。测定不同培养条件下内生细菌ZHAB63对细辛菌核病菌抑菌率，确定辽藁本根部内生细菌ZHAB63最佳培养条件。

1.6 数据分析

用正交设计助手Ⅱv3.1设计试验，Excel 2007计算统计数据和制作图表，SPSS 25.0作方差分析。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离纯化与筛选

从辽藁本植株中共分离到内生细菌64株，其中根中31株；根茎中33株。发现23株内生细菌对11株植物病原菌中至少1种供试植物病原菌产生拮抗作用（见表3），长春产区辽藁本根中分离到29株内生细菌，通化产区辽藁本根中仅分离2株内生细菌，长春产区根中分离内生细菌数量高于通化产区，根中具有拮抗作用株菌占总菌数17.19%；两产区根茎部位分离内生细菌数量相近，根茎中具有拮抗作用株菌占总菌数18.75%。

辽藁本内生细菌采用生长速率法初筛，对至少一种植物病原菌存在拮抗作用的内生细菌有23株（见表4）。部分内生细菌复筛抑菌结果如图1所示。

表3 两产区样品中具有拮抗作用内生细菌分布比例Table 3 Proportion of antagonistic endophytic bacteria in samples from two regions

表4 内生细菌初筛结果Table 4 Endophytic bacterial preliminary screening results

图1 部分内生细菌复筛抑菌结果Fig.1 Partial endophytic bacteria rescreening and bacteriostatic results

其中对细辛菌核病菌、人参灰霉病菌有拮抗作用菌株最多，占有抑菌作用拮抗菌总数91.30%；其次对人参根腐病菌有拮抗作用菌株，占有抑菌作用拮抗菌总数82.61%；对防风灰霉病菌、防风根腐病菌及苍术立枯病菌有拮抗作用内生菌株大致相同，占65.22%；对细辛叶枯病病菌具有拮抗作用菌株最少，仅12株，占拮抗菌株52.17%。对9种以上供试植物病原菌存在拮抗作用内生菌株6株，其中分离于根部ZHAB63菌株对11种供试病原菌均产生明显抑制作用，且拮抗率均大于50.00%，该内生菌菌株在对供试植物病原菌抑制作用具有广谱性。抑菌率≥70%内生菌株2株，辽藁本内生细菌ZHAB3及ZHAB63菌株分别对人参疫病病菌及细辛菌核病菌抑菌率均大于70%，说明辽藁本内生细菌对这2种供试植物病原菌抑制作用具有专一性。就细辛菌核病菌而言，ZHAB63菌株的抑菌率大于70%，达极显著差异（P＜0.01）；对人参疫病病菌拮抗筛选中，ZHAB3菌株抑制效果较好，为最高抑菌率，达显著差异（P＜0.05）；其余供试植物病原菌拮抗作用不明显，拮抗率均未达到70%。

对ZHAB63菌株拮抗11种植物病原菌结果作方差分析（见表5），对细辛菌核病菌抑菌效果达极显著（P＜0.01），抑菌率在11种供试植物病原菌中最高，故将细辛菌核病病菌作为测定ZHAB63条件优化抑菌率的供试植物病原菌。

表5 菌株ZHAB63复筛结果Table 5 Rescreening results of strain ZHAB63

2.2 菌株ZHAB63鉴定

2.2.1 形态特征观察

菌株ZHAB63接种于牛肉膏蛋白胨培养基，28℃培养48 h后，菌落呈淡黄色无光泽，表面干燥、粗糙、不透明，培养基上无色素积累，液体培养基表面形成一层薄膜。通过光学显微镜观察发现菌体呈杆状，革兰氏染色为阳性。

2.2.1 分子鉴定

PCR扩增使用通用引物获得菌株ZHAB63的16SrDNA序列长度为1 460 bp。将所得16SrDNA序列与NCBI数据库作BLAST比对分析，采用MEGA7.0中NJ法构建系统发育树。结果表明，内生菌株ZHAB63与芽孢杆菌属（Bacillus）相似度高达99%，由此判断ZHAB63菌株为芽孢杆菌属中一个种。通过选取NCBI数据库中与ZHAB63序列同源性较高的菌株构建系统发育树（见图2）。菌株ZHAB63与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefa⁃ciens）（HQ831399.1）聚于同一分支，其序列同源性为99%。结合形态学特征观察及系统发育树分析，初步将菌株ZHAB63鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.am⁃yloliquefaciens）。

2.3 ZHAB63菌株发酵条件优化

2.3.1 正交设计确定最佳组合

R值（极差）高低顺序（RD＞RC＞RB＞RA）表明，影响菌株ZHAB63发酵液抑菌活性因子强度由强到弱依次为硫酸镁、蛋白胨、酵母粉和蔗糖。K值反映每个因素在3个不同水平中抑菌能力差异。从4个因素K1、K2、K3中选择最大值，即每个因素最优水平；4因素最优水平组合即ZHAB63菌株发酵液最优组合。故ZHAB63菌株培养基最优组合为A2B2C2D2（如表6所示），即蔗糖（15.0 g·L-1）、酵母粉（20.0 g·L-1）、蛋白胨（20.0 g·L-1）、硫酸镁（5.0 g·L-1）。

2.3.2 菌株ZHAB63培养条件优化

结果见图3。

图2 ZHAB63菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZHAB63

表6 正交试验L9（34）结果及极差分析Table 6 Analysis of range and result of orthogonal experiment

图3 不同培养条件对ZHAB63菌株抑菌率的影响Fig.3 Effects of different culture conditions on inhibition rate of ZHAB63

由图3可知，各因素抑制细辛菌核病菌生长。菌株培养48 h时，抑菌率达84.99%，后缓慢进入衰退期，抑菌率呈下降趋势；菌株在26～32℃均可生长，菌株抑菌率随温度升高而增大，但随温度升高，拮抗率呈下降状态，菌株随温度变化甚至死亡；转速180 r·min-1时，菌株抑菌率最大，达83.12%，超过180 r·min-1后，随转速增大，抑制率呈下降趋势；菌株适合在偏弱酸（pH 6.5）环境下培养，强酸或强碱均抑制菌株生长，严重时甚至导致死亡。

最佳培养条件为：48 h，30 ℃，180 r·min-1，pH 6.5时抑菌率最高为84.99%（见图1A-Ⅰ）。结果表明，优化后ZHAB63菌株等量发酵液置于相同发酵条件下抑菌率为84.99%，显著大于NA培养基发酵液抑菌率72.22%（见图1A-Ⅱ），优化前后拮抗效果如图1A所示。

3 讨论与结论

3.1 内生细菌分离与拮抗菌株筛选

内生细菌在植物体内普遍存在，但从不同植物体内分离到内生细菌种类和数量存在较大差异，主要与分离方法、培养条件及环境因素等有关[15]。在杜仲、连翘、细叶小檗、明党参等药用植物内生菌与宿主关系研究中，不同地区同一种植物分离的内生细菌会因植株生长环境等因素导致内生菌种类、数量存在明显差异，同一株植物不同部位内生菌种类也存在差异[16-17]。本研究采用传统组织表面消毒法共分离64株内生细菌，长春产区分离得到内生细菌总数多于通化产区，长春产区根中分离内生细菌多于根茎，通化产区则相反。可能与辽藁本栽种环境及土壤中存活微生物种类有关。但目前普遍采用的组织表面消毒法可能存在局限性，需进一步优化内生细菌分离方法加以证实。

药用植物特殊内环境，通过拮抗活性试验，大多数植物可筛选出具有拮抗活性的内生细菌。饶小莉等从乌拉尔甘草根茎叶组织中分离内生细菌，通过平板对峙法筛选6株对植物病原菌存在拮抗作用菌株[18]。赵智灵等分离筛选吉林省12个主产区人参，采用滤纸片法筛选4株对人参病原真菌具有拮抗活性内生细菌[14]。

从吉林省2个主产区采集辽藁本根、根茎组织分离内生细菌，获得多株内生细菌，同时采用生长速率法获得一株广谱性ZHAB63菌株，对细辛菌核病菌具有极显著抑制作用，该研究将丰富药用植物辽藁本生防菌菌种资源库，为人参、细辛、防风等植物病害生物防治提供新资源和新途径。

3.2 内生细菌ZHAB63鉴定

物种鉴定是内生细菌研究基础性工作，辽藁本内生细菌鉴定采用菌株形态观察、16SrDNA基因序列测定以及系统发育树相结合方法，与大多植物如人参[14]、水稻[19]等内生细菌鉴定方法一致。16SrDNA序列分析是分子遗传学鉴定法中重要鉴定方法之一，可快速准确鉴定目前尚无法人工培养微生物，准确率相对较高。脂肪酸鉴定广泛应用于植物细菌鉴定和多样性研究[20-21]，但鉴定方法相对落后。需有相对全面基因序列的数据库，否则鉴定结果准确率较低，与其他鉴定技术结果差异较大，故逐渐被新鉴定技术替代。16S rDNA序列分析是目前标准微生物鉴定方法。将PCR测序拼接结果在基因数据库中检索，查询相似度最高序列，构建系统发育树确定菌株种属地位，可准确定位植物内生细菌，为辽藁本内生细菌ZHAB63鉴定提供快速有效技术手段，为后续深入研究提供基础。

芽孢杆菌属内生细菌对植物病原真菌多具有抑菌性[22-23]。本研究筛选解淀粉芽孢杆菌ZHAB63，结合形态学特征及16SrDNA序列分析，根据已报道解淀粉芽孢杆菌特征描述[22]，鉴定ZHAB63菌株为芽孢杆菌属Bacillus中解淀粉芽孢杆菌B.amylo⁃liquefaciens。菌株ZHAB63对11株药用植物病原真菌均具有高于50%拮抗率，其中对细辛菌核病菌拮抗率达72.22%，且经多次验证后抑菌效果均较为稳定。可能由于内生细菌生长过程分泌的代谢产物中含有降解植物病原菌酶类，对细辛菌核病菌抑制效果比较显著，因此对细辛菌核病菌拮抗作用最明显，但需进一步验证。

3.3 ZHAB63菌株培养条件优化

研究表明，优化生防菌培养液组分及培养条件可提高菌体抗菌活性含量，其中关于解淀粉芽孢杆菌发酵条件优化较多。章小洪等报道B.amylo⁃liquefaciens BW-13菌株以玉米粉、蛋白胨为培养基主要成分，pH 5，28℃，200 r·min-1，发酵144 h后，菌株拮抗率最高[24]；张淑梅等优化内生菌株TF28液体发酵条件发现，最优培养基配方为葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、碳酸钙，初始pH 7.5，30 ℃，200 r·min-1培养48 h为最佳发酵条件[25]。本研究通过不同碳源氮源无机盐筛选优化B.amyloliq⁃uefaciens ZHAB63最佳发酵培养基成分为蔗糖15.0 g·L-1，酵母粉 20.0 g·L-1，蛋白胨20.0 g·L-1，硫酸镁5.0 g·L-1，与多数解淀粉芽孢杆菌生长所需营养成分相似。B.amyloliquefaciens可利用大多数生物无法利用的单碳或非C-C键多碳化合物，菌株ZHAB63液体发酵培养基所需最佳碳源为蔗糖，优于葡糖糖等其他碳源。ZHAB63菌株对复合氮源利用能力较单一氮源强，将蛋白胨和酵母粉以同等比例混合作培养基氮源，其抗菌活性较单一氮源高，达显著水平。同时，菌株ZHAB63对无机盐需求较高，加入硫酸镁对菌株影响最大，可能与分泌抗菌活性成分有关。B.amyloliquefaciens ZHAB63最适温度为30℃，pH 6.5为弱酸性，与张淑梅等报道温度结果一致，但弱碱性适合B.amyloliquefa⁃ciens菌株生长存在差异[25]。可能由于解淀粉芽孢杆菌来自不同宿主植物，其适宜生长环境不同，植株中内生细菌生物学特性及产生抑菌物质能力不同。优化后转速为180 r·min-1、发酵时间48 h，与张淑梅等发酵时间一致[25]，转速差异较小。优化后抑菌率达84.99%，比优化前72.22%有所提高，表明优化后更有利于菌株ZHAB63中抑菌活性物质生成。因此，探究优势内生菌株ZHAB63最佳发酵条件为后续研究及推广应用提供重要理论依据，为内生解淀粉芽孢杆菌应用奠定基础。

本研究表明，辽藁本中含有丰富内生细菌资源，存在拮抗东北常见药用植物病原真菌的高活菌株，可作为防治人参、细辛等东北道地药材常见植物病原真菌病害新方法，尤其对细辛菌核病防治开发前景较好。培养条件优化后，菌株ZHAB63对植物病原菌拮抗作用增强。后续研究需进一步测定解淀粉芽孢杆菌ZHAB63菌株在辽藁本植株内定殖情况及对辽藁本生长的影响，评估其对细辛菌核病菌、人参菌核病菌等多种植物病菌生物防治的安全性及田间防病效果，同时注意提高植物内生细菌在药用植物病害生物防治中的广谱性和安全性。