白桦脂酸通过抑制NLRP3/NF-κB 信号通路保护四氯化碳所致肝损伤的机制研究*

严丽军，徐立新，何红梅，居玲玲，张湘云，邵建国***

(南通大学附属南通第三医院1 肝病科，2 消化内科，3 肿瘤科，南通 226006)

肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度沉积，它不是一个独立的疾病，是许多慢性肝病共同的病理过程，几乎各种慢性肝病(化学毒性、感染性、遗传代谢性、自身免疫性以及胆汁淤积性)均可导致肝纤维化[1-2]。早已证实肝纤维化及早期肝硬化都是能够实现逆转的。ECM生成及降解过程中所出现的失衡是肝组织在发生纤维化过程中重要的可逆性病理变化[3]。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)已被证实是弥漫性ECM的重要来源之一，且激活HSC 转变为肌成纤维细胞(myo fibroblast,MFB)是肝纤维化发生的中心环节[4-5]。HSC 活化过程中会产生大量的促炎细胞因子、趋化因子和分子，炎症是HSC 活化过程的关键因素[6]。许多炎症因子在HSC 的活化过程中起关键作用，如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1β 和IL-6 等。此外，核因子(nuclear factor,NF)-κB、活性氧、脂质过氧化产物和多种生长因子均可促进HSC 的活化，与MFB 积累在一起，最终导致肝纤维化多种信号通路的核心病理生理改变[7]。

四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)是最有效的肝毒性化合物之一，使用CCl4构建的动物肝损伤模型是肝损伤的经典模型[8]。CCl4经依赖于细胞色素P450 的氧化酶激活后，分解为CCl3-和Cl-，而这些自由基会导致活性氧及脂质过氧化物的过量产生，进而对肝细胞产生损伤，促进肝纤维化的发生发展[9]。因此，本实验采用CCl4复制肝损伤小鼠模型。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotidebinding oligomerization domain,jeucine rich repeat and pyrin domain containing,NLRP3)炎性小体是一种存在于细胞质中的蛋白复合物，是宿主免疫防御系统的重要成员，主要参与体内炎性反应，其主要组成包括NLRP3、效应蛋白胱天蛋白酶-1(Caspase-1)及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)[10]。NLRP3 炎性小体在肝脏中主要位于肝细胞，Caspase-1 对于将IL-1β未成熟型转化为活性型至关重要，NLRP3 对刺激的反应需要NF-κB 信号通路的参与。

白桦脂酸(betulinic acid,BA)是一种羽扇豆烷型五环三萜皂苷，存在于多种天然植物的树皮中，主要在桦木属中。研究[11-14]已证实BA 具有抗肿瘤、抗炎、抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、抗人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、免疫调节等多种药理作用。但关于BA 是否对肝损伤有益的研究仍很少。因此，本研究旨在评估BA 对肝损伤发生时肝纤维化的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 药物 BA 和水飞蓟素(silymarin,SL)(纯度均为97%)均购自天津万象恒远科技有限公司，且均使用5%CMC-Na 进行混悬备用，BA 高、低剂量浓度分别为4、2 mg/mL；CCl4(纯度为99.5%)购自上海阿拉丁生化科技公司。

1.2 动物来源 购自南通大学实验动物中心的60只C57BL/6 小鼠(雄性，8～12 周龄，20～22 g)，饲养条件为室温(22±1)℃、空气湿度40%～50%、昼夜交替时间12 h、普通喂养及自由饮水，动物实验由南通大学实验动物伦理委员会批准。

1.3 试剂 IL-6、IL-1β 和TNF-α 酶联免疫试剂盒采购于Elabscience 公司(批号为Ex210804)；NLRP3、甘油醛-3-磷酸脱氧酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、ASC、Caspase-1、(p-)NFκB、IL-1β、(p-)IκBα 抗体均来源于Cell Signaling Technology。

1.4 仪器 曝光仪(型号：Tanon 5200，上海天能科技)；台式离心机(美国SCILOGEX 公司)；DYC 电泳仪(北京六一仪器厂)；酶联免疫检测仪(型号：680 型，上海众生声明科学)。

1.5 实验方法

1.5.1 分组与给药 60 只C57BL/6 小鼠随机分为5组：空白对照组、CCl4组、CCl4+SL(100 mg/kg，阳性药物)、CCl4+BA 低剂量组(20 mg/kg)、CCl4+BA 高剂量组(40 mg/kg)，皮下注射CCl4(橄榄油1∶1)诱导小鼠肝纤维化，剂量为3 mL/kg，每周2 次，连续6 周。空白对照组小鼠注射等量无CCl4的橄榄油。建立肝纤维化模型后，BA组小鼠灌胃BA 20、40 mg/kg，SL组小鼠予SL 100 mg/kg 溶于生理盐水灌胃，连续6 周。空白对照组和CCl4组小鼠接受等量生理盐水。

1.5.2 血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)含量测定 末次给药24 h 后小鼠眼眶采血，于4 500 r/min 离心15 min 后取上清液冻存于-80 ℃备用，依据试剂盒说明书对CCl4所引发的肝脏损伤小鼠模型血清中ALT、AST 的水平进行检测。

1.5.3 血清及肝脏组织中细胞因子测定 末次给药24 h 后眼眶取血，离心15 min(4 500 r/min)后将其上层清液取出并储于-80 ℃备用，依据酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒说明书对5组小鼠血清中细胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平进行检测。用RIPA 裂解液提取各组小鼠肝脏组织总蛋白，离心15 min(12 000 r/min)后将其上层清液取出并储于-80 ℃条件中备用，依据试剂盒说明书检测5组小鼠肝脏组织中细胞因子(IL-6、IL-1β 和TNF-α)的含量。

1.5.4 肝脏组织病理学观察 将处死后的小鼠肝组织取出，4%甲醛固定，石蜡包埋制成厚4 mm 的薄片，进行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色，置于显微镜下对肝组织的病变情况进行观察。

1.5.5 免疫组化法测定小鼠肝脏中NLRP3 和p-NF-κB-p65 的表达情况 用4%多聚甲醛固定肝组织，将其包埋在石蜡中并切片，将石蜡切片在二甲苯和无水乙醇中脱蜡，在柠檬酸钠缓冲液中微波干燥，并用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤；内源性过氧化物酶活性被3%H2O2阻断20 min；将每个样品用5%山羊血清封闭20 min，然后在4 ℃下用一抗NLRP3(1∶200)和p-NF-κBp65(1∶200)处理；第2 天，PBS 洗涤3 次后，用山羊抗兔IgG 二抗处理20 min，然后将辣根过氧化物酶标记的抗生蛋白链菌素工作液孵育20 min，PBS 洗涤3 次，然后用3-3′二氨基联苯胺染色，最后苏木精染色，脱水并干燥后，将切片用中性胶固定并在显微镜下观察。

1.5.6 NLRP3/NF-κB 相关蛋白含量测定 使用RIPA 裂解液提取小鼠肝组织总蛋白，离心15 min(12 000 r/min)后收集上清液，通过BCA 试剂盒定量分析各蛋白含量。通过SDS-聚丙烯酰胺电泳将各蛋白样本移至PVDF 膜上，随后将其放置在含量为5%脱脂牛奶中封闭2 h；完成封闭后，将膜置于相对应的一抗当中，在4 ℃环境中过夜孵育；次日进行4 次TBST 清洗，单次清洗时间为8 min，随后放置在二抗中，在室温条件下摇晃孵育2 h，将膜取出进行4 次清洗(TBST 清洗)，单次清洗时间为8 min，最终在凝胶成像仪中曝光并进行扫描，分析各条带的灰度值。

2 结 果

2.1 BA 对CCl4诱导的肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响 与空白对照组比较，小鼠在被注射CCl4后，血清ALT、AST 含量显著增加；与CCl4组相比，BA 高低剂量组小鼠血清ALT、AST 含量显著降低，见图1。

2.2 BA 对CCl4诱导的肝损伤小鼠血清与肝脏中细胞因子的影响 与空白对照组比较，CCl4组小鼠血清与肝脏组织中细胞因子(IL-6、IL-1β 和TNF-α)含量都出现了明显的上升；相较于CCl4组，BA 高、低剂量组小鼠血清与肝脏组织中细胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)含量明显下降，见图2～3。

2.3 BA 对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝脏组织病理改变的影响 空白对照组小鼠肝组织结构无异常，肝细胞正常；而CCl4组小鼠的肝组织切片显示肝细胞坏死、脂肪变性，门静脉系统炎症反应严重；BA 高低剂量组则改善了CCl4导致的肝损伤小鼠的病理改变，见图4。

2.4 BA 对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝脏组织NLRP3/NF-κB 通路蛋白表达的影响 相较于空白对照组，CCl4组小鼠肝脏组织中NLRP3/NF-κB 通路相关蛋白(NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、p-NF-κB-p65及p-IκBα)含量明显增加；相较于CCl4组，BA 高低剂量均能抑制小鼠肝组织中NLRP3/NF-κB 通路相关蛋白的表达，见图5。

2.5 BA 对CCl4诱导的肝损伤小鼠肝脏组织NLRP3 免疫组化的影响 相较于空白对照组，CCl4组小鼠肝脏组织中NLRP3 蛋白含量明显增加；相较于CCl4组，BA 高、低剂量组小鼠肝组织中NLRP3 蛋白含量明显减少，见图6。

3 讨 论

本文采用CCl4诱导的肝损伤模型，发现BA 能显著降低模型小鼠血清中转氨酶(ALT、AST)的活力，能减少CCl4诱导的肝损伤细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α 等促炎细胞因子的含量，且Western Blot 结果提示BA 可能是通过抑制NLRP3/NF-κB 信号通路起保护作用的。

ALT 和AST 为常用的肝纤维化检测指标，二者均位于肝细胞中，当细胞膜受损或细胞变性坏死时可释放入血，因此血清中ALT、AST 水平能很快反映出肝细胞的损伤情况。AST 分布于细胞浆和线粒体内，ALT 主要分布于细胞浆中，ALT 是肝损伤早期敏感性最强的转氨酶，因此在诊断肝损伤中具有重要作用，其高低往往与病情轻重相平行；当出现肝损伤之后，AST 的变化幅度远超ALT 而成为反映肝脏损伤程度的主要指标。在本研究中，小鼠血清中转氨酶的检测结果显示，CCl4损伤肝细胞后AST 和ALT 的含量均增加，而BA 干预后则降低了AST 和ALT 的水平。

在造成肝损伤的各种原因之中，炎性反应具有重要的地位，减轻炎性反应可有效缓解肝损伤，因此在肝损伤的治疗中，抗炎保护肝细胞至关重要[15]。当肝细胞存在实质性损伤时，因受到外界的刺激而释放大量炎性因子，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等，并作用于HSC、Kuffer 等细胞表面，从而诱发正向反馈调节，最终造成炎性因子的增加并加速病情的发展。IL-1β、IL-6、TNF-α 等含量在发生肝损伤后会显著增加，并随着病情的发展而不断升高，说明在急性肝损伤的全程中IL-1β、IL-6、TNF-α 均有参与。在本研究中，CCl4刺激后血清和肝组织中的IL-6、IL-1β和TNF-α 均大幅度提升，而BA 能对CCl4所导致的肝组织中炎性因子的释放能有效地抑制。

NF-κB 是Rel 蛋白家族的一员，其发挥生物学活性的主要形式是由p65/p50组成的异二聚体。在静息状态下，NF-κB 可与IκBα 结合形成三聚体，在细胞质中以无活性的方式存在，受到外界刺激时会对一系列蛋白激酶进行激活，如NLRP3 炎性小体等，从而诱导产生炎性反应。NLRP3 在激活炎症因子IL-1β 和IL-18 之后，导致宿主发生炎症反应[16-17]。NF-κB/NLRP3 通路在肝损伤过程中的炎性调节作用已明确。本研究表明，BA 能有效抑制CCl4诱导的肝损伤小鼠肝脏组织中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、p-NF-κB-p65 及p-IκBα 的表达。

综上所述，本研究提示BA 可有效缓解CCl4诱导的小鼠肝损伤，且这一作用可能依赖于NF-κB/NLRP3 信号通路，其深入机制有待进一步研究。