不同杨树品种DNA指纹图谱特征研究

王兴胜 林琪 曹龙 朱秋萍

摘   要：为丰富杨树栽培品种的遗传信息，收集了中国北方地区广泛栽培的33个杨树品种，进行指纹图谱构建、系谱关系鉴定和遗传多样性分析。利用SSR技术对33份杨树种质进行指纹图谱构建和系谱关系鉴定。从杨树SSR数据库中选取22对SSR引物，挑選出4 对扩增条带清晰、具有多态性且重复性好的引物，对33份杨树种质进行筛选与鉴定，并构建指纹图谱，利用NTEDIT.LINK进行聚类分析，其聚类结果与传统分类学上的结果一致。研究表明，SSR 分子标记技术在杨树品种鉴定中具有一定的可靠性，同时为开展杨树资源遗传亲缘关系分析和杂种优势等开发利用提供了重要的参考。

关键词：杨树品种;DNA指纹图谱;特征

文章编号： 1005-2690（2020）10-0006-03       中图分类号： S792.11       文献标志码： B

杨树是我国重要的绿化树种和能源树种之一。杨树为落叶乔木，分布广泛且种类多种多样。近年来，由于国家对林木繁育种业的高度重视，育种技术和杨树速生优良新品种的选育速度也逐渐加快。但是，由于杨树驯化历史悠久，其生物学性状受生长发育阶段和环境因素的影响，仅通过形态学不利于新品种权的保护，并且作为品种区分标准实为困难。因此，采取植物的幼嫩部位提取DNA[1-2]，利用SSR分子标记技术进行遗传多样性分析并构建指纹图谱，以此保证品种的特异性，为后期品种鉴定及良种审定提供有效信息。

1   材料和方法

1.1   材料

分布在新疆不同生态区域内的33个杨树品种。

1.2   DNA提取

提取DNA采用改良CTAB法[3]。具体操作步骤如下。

（1）取幼嫩真叶材料一小片，用蒸馏水冲洗干净，置1.5 mL的离心管中，加液氮，快速冷却。

（2）将材料快速研磨成粉末，然后加入 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液700 μL。

（3）放入 65 ℃水浴30～40 min，每10 min 轻轻地振荡一次。

（4）加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1）700 μL，混匀5 min，12 000 rpm离心5 min。

（5）取上清液，转入另一个1.5 mL新离心管中，加入预冷的无水乙醇800 μL， 放置于4 ℃静置10 min左右，让DNA充分沉淀。

（6）清除无水乙醇，加入预冷70%乙醇漂洗两次。

（7）室温晾干，轻轻弹离心管，至没有水滴即可。

（8）将DNA溶于50 μL或100 μL的 0.1倍TE中，加入RNase（10 mg/mL）1 μL于37 ℃消化15～30 min。

（9）于-20 ℃或4 ℃条件下保存。

1.3   SSR标记引物序列的获得及合成

通过引物筛选，将多态性丰富且稳定性好的SSR引物用于杨树品种的鉴定及遗传多样性分析。具体筛选的引物组合见表1。

1.4   SSR反应体系

1.4.1   SSR标记技术杨树扩增反应试剂反应体系

1.0 μL 330 ng/μL DNA、2.33 μL 10×Buffer（含Mg2+）、1.6 μL dNTPs（2.33 mM each）、0.33 μL 10 pM Forward primer、0.33 μL 10 pM Reverse primer、0.233μL 33 U/μL Taq polymerase、18.633 μLddH20，将上述反应物混匀后于PCR仪（PTC-200TM Peltiter thermal cycler）上进行扩增。

1.4.2   反应程序

94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，以上循环35次后，72 ℃ 10 min，最后放置10 ℃保存。

1.5   非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

6%聚丙烯酰胺凝胶配方：6 mL聚丙烯酰胺胶母液，2 mL 10×TBE超纯水10 mL，200 μL10%过硫酸胺，20 μL TEMED。

1.6   银染

通过固定、染色、显色、漂洗一次，自然晾干后扫描。

1.7   读带记录并分析

取出干燥后的凝胶，对其形成的DNA多态性图谱进行读带，同一位置没有条带的记“0”，清晰的记“1”，生成“1”和“0”组成的原始矩阵。利用NTSYS-2.10e 软件求Dice相似系数矩阵，用UPGMA方法进行聚类分析，最后生成聚类图通过Tree plot模块。

2   结果与分析

2.1   品种鉴定

利用22对SSR 引物对33份杨树品种进行鉴定，挑选出了4对多态性较好的引物进行筛选和鉴定。结果表明：引物PMGC2839、PMGC2885、PMGC571和ORPM206分别扩增出（除15号和21号品种之外的）31个品种的特异性条带。电泳结果见图1，指纹图谱见图2。

2.2   遗传多样性分析

采用4对SSR引物对33份杨树品种进行聚类分析，结果见图3。

3   结论

通过SSR分子标记技术对33份杨树种质建立指纹图谱和鉴定系谱关系，结果表明：4种引物，包括PMGC2839、PMGC2885、PMGC571和ORPM206能够较好地区分33份杨树品种（除111和171号品种）。这些 SSR标记所构建的指纹图谱，可用于杨树品种的区分和鉴定。

参考文献：

[ 1 ] 李荣旗，张开春，尹淑萍，等.从苹果、山楂等果树韧皮部快速微量提取总DNA用于RAPD分析（简报）[J].农业生物技术学报，1997，5（1）：98-99.

[ 2 ] 王孝安，肖娅萍，胡雅琴.太白红杉3种不同材料总DNA的提取[J].西北植物学报，2003，23（4）：641-644.

[ 3 ] 黄烈健，苏晓华，张香华，等.与杨树木材密度、纤维性状相关的SSR分子标记[J].遗传学报，2004，31（3）：299-304.