不同霉菌对白酒丢糟中粗纤维降解试验

兰小艳，陈雪玲，郭云霞，张敬慧

(宜宾职业技术学院 五粮液技术与食品工程学院，四川 宜宾 644000 )

白酒丢糟中含有淀粉(10%左右)、粗纤维(20%左右)、粗蛋白(7%～9%)、有机酸、低碳糖、杂醇等有机成分[1]，纤维素的降解是世界性的难题。据统计[2]：现在全国一年的饲料用粮大概占全国粮食总产量的23%左右，白酒酿造行业每年耗粮达几千万t，而酒糟生产干饲料所节省的饲料用粮，相当于酿酒用粮的30%。即一个年产万t的酒糟加工饲料厂，每年可为国家节省饲料粮万吨以上[3]。酒糟中纤维素含量较高，对除反刍动物以外的牲畜的适口性较差，因此降解酒糟中纤维素的含量显得尤为重要[4]。所以搞好酒糟的综合利用，在节粮的基础上还可以增加经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验所用菌种名称康宁木霉(Trichoderma koningii)，来源于中国工业微生物菌种保藏中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),CICC编号为40852；白腐菌，来源于四川省南开大学生物研究室，编号为30942；白酒丢糟，由四川省宜宾某酒业提供；麸皮为市售；高压灭菌锅(XFS-280MB+)，购自光合电子有限公司；超净工作台(SW-CJ-1FD/SW-CJ-2F)，购自力辰科技有限公司；生化培养箱( LRH-70)，购自上海一恒科学仪器有限公司；干燥箱(101-1A)，购自光合电子有限公司；电子天平(万分之一)，购自万特电子有限公司生产。

1.2 试验方法与设计

1.2.1 设计分为4组试样：

试样1 康宁木霉 20-30℃自然室温试样2 康宁木霉 恒温2 8℃试样3 白腐霉 20-30℃自然室温试样4 白腐霉 恒温2 8℃

分别在发酵第0，10，15，20，25，30，35 d测定纤维素的含量，比较纤维素的降解效果。

1.2.2 菌种的活化及扩大培养

将买回来的纯种菌株通过平板划线法转接到灭菌后的斜面试管马铃薯培养基上继续培养，观察菌种的活力，反复转接，直到菌种的活化程度增强。选择活化力很强的菌株，将纯种的菌株用上述方法转接到更大的试管，继续培养得到更多的菌株。

1.2.3 酒糟的预处理

本试验所用的酒糟是从四川省宜宾某酒业取回的鲜糟，取回后立即用pH试纸测其初始酸度值，取其中的一部分酒糟放置在阳光下曝晒，使其水分挥发待测，另一部分酒糟用培养皿分装后放于烘箱内干燥待测。

1.2.4 酒糟降解试验

(1)小样试验：筛选出经过培养后活力较强的菌体，将其转接到添加了1g酒糟的培养基上，继续培养并观察两种菌的活化力。培养1周后，发现两种菌体都能生长，且菌丝生长茂盛。

(2)降解试验：选择培养的康宁木霉和白腐霉纯种菌株，分别用等量的无菌水脱洗在装满酒糟的无菌瓶中(见图1)。将试样2和试样4置于恒温培养箱，将温度调节到28℃，周期为五天；将试样1和试样3置于室内透光、通风、阴凉处，每次多次测其室温变化；定期检测酒糟的纤维素含量，分析降解效果。

图1 降解试验Fig.1 Degradation test

1.2.5 检测方法

采用中性洗涤纤维[5]方法，用酸、碱及乙醇依次消化酒糟，灰化后除去无机物即得纤维素。

2 结果与分析

2.1 粗纤维的含量测定

表1 经康宁木霉发酵后酒糟纤维含量的测定 %Table 1 the determination of Trichoderma koningii fermented lees fiber content

表2 经白腐霉发酵后酒糟纤维含量的测定 %Table 2 Determination of fiber content of distiller's grains after fermenting white rot

2.2 粗纤维的平均值

表3 酒糟纤维含量的平均值 %Table 3 average fiber content of distiller's grains

2.3 降解纤维素程度的分析

结合表3及图2分析，可以得出如下数据：

(1)20 ～30℃自然室温，康宁木霉的降解率为5.06%。尤其是前20天降解效率是最高的。而白腐霉的降解率为5.67%，白腐霉的降解效果是最佳的，尤其是20～25天这一个周期内，降解迅速。总的来说白腐霉的降解率比康宁木霉的降解率高出0.61%。

(2)恒温28℃，康宁木霉的降解率为5.03%。虽然是降解效率是最差的，但它的降解速率是趋于稳定下降的。白腐霉从25.04%降到19.95%，其降解率为5.09%。它的降解速率是最缓慢的，前20天效果不明显。白腐霉的降解率略高出康宁木霉0.06%。

(3)30天以后，所有试样的纤维素含量都保持不变。

图2 纤维素降解效果线形分析Fig.2 linear analysis of cellulose degradation effect

3 小结

3.1 酸碱度的影响

pH值不同会影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，从而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，菌体在适合的pH值下可以获得最佳培养效果[6]。根据相关资料查出[7]，白腐霉和康宁木霉在pH值为1.5～8.5的范围内都能够生长，其最适pH值分别为4.5～5.5和4～5。由于本次所用的酒糟是由某酒业提供的鲜糟，粗测其酸度为3～4，与两种菌的最适pH值不符，因此，在酒糟中适当添加了2滴NaOH，以调节酒糟的酸碱度，使其适合这两种菌的生长繁殖。

3.2 水分的影响

酒糟中含有适当的水分有利于霉菌的生长繁殖。据查证[8]，霉菌的生长繁殖所需的水分含量为40%～50%。在选择酒糟之前，粗测酒糟中水分含量，相比较而言，经太阳晒干的酒糟(其水分含量在44%左右)更适合于霉菌的生长繁殖[9]。此外，太阳曝晒的同时还可以杀灭酒糟中本身存在的杂菌，以及将残余酒精挥发掉，更有利于发酵操作的进行。

3.3 淀粉及脂肪的影响

众所周知，碳源是构成菌体的碳架及能量的来源[10]。酒糟纤维中的木质素降解是一个次生代谢过程，必须有其他碳源来支持微生物的生长，而酒糟中残余淀粉可以被一些酶类分解为单糖，作为微生物的碳源供给[11]。如果残余淀粉量不足，便会影响霉菌的生长繁殖，使纤维素降解速率下降。

测得该酒糟的淀粉含量为17%，脂肪含量不足5%，不足以提供微生物所需的碳源物质，因此在酒糟预处理中，添加了0.1 %葡萄糖和0.2 %的麦麸，使纤维素的降解率高于资料中显示的5%。

3.4 蛋白质的影响

酒糟中的蛋白质可以给霉菌提供有效的氮源，也可以作为饲料中有效的营养成分[12]。根据研究表明[13]：发酵酒糟中氮的含量与粗蛋白质的提高幅度呈正相关关系，但与白腐真菌的生长发育呈负相关。氮源的消耗直接影响木质素降解酶的产生，木质素降解酶为次级代谢酶，在自然状态下，通常氮源耗尽才产生[14]。因此，酒糟中氮的含量是影响霉菌降解效果的因素之一。

3.5 温度的影响

温度的高低直接影响霉菌的产酶能力，温度过高，则降低酒糟纤维素中木质素的降解率；温度过低，霉菌固体发酵的进度缓慢。有资料显示[15]：30℃培养条件更利于木质素降解酶的产生。大多数霉菌适宜的生长温度为20～35℃。

本试验首选的温度是恒温28℃，这个温度适宜两种菌体的生长繁殖，其次选择了自然室温。由于室温随时都在改变，所以有很多不确定性，为了降低菌体的衰亡率，每天对室温进行检测。由检测结果得出室温的波动范围在20～30℃，这个温度范围不会造成菌体的衰亡，因此本试验中设定温度对降解效果的影响不大。

3.6 其他因素的影响

(1)本次试验使用的酒糟在发酵过程中是敞开无菌瓶盖的，外界微生物对降解效果有一定的影响。根据资料显示，空气中有部分细菌以及放线菌对纤维素有一定的降解效果。此外，酒糟发酵过程中的一些特殊酵母菌也可以降解纤维素。

(2)发酵时间是影响霉菌降解纤维素的效率之一。发酵时间过短，霉菌处于生长阶段，对木质素的降解作用不大，只有当霉菌进入繁殖阶段，才会大量降解木质素。但是发酵时间也不宜过长，木质素一旦被降解得过多，其他容易消化的糖类一同被降解，会造成酒糟中的营养成分降低。

(3)由于检测操作比较复杂繁琐，不能在同一时间检测完所有的样品，因此进行了分批次检测。受外界环境干扰，检测结果也受其影响。

4 结论

通过比较两种霉菌对酒糟中纤维素的降解试验，初步结果表明，纤维素总体降解率不高，只有5%左右。在本试验设定的条件下，白腐霉比康宁木霉多降解了0.67%的纤维素，且两种菌体在20 ～30℃变化的温度条件下更容易繁殖代谢。由于前25天纤维素降解明显，后10天变化不大，尤其是最后5天降解几乎不改变，可以得出本试验中所用的酒糟纤维素的降解周期在30天以内。

对于本试验，影响纤维素降解率的因素有pH值、水分、温度、碳源和氮源的供给，以及检测方法，要进一步比较两种菌体的降解效果，就须尽量减小这些因素的因素影响，进而取得的降解效果将更加明显准确。