多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗患者血清miRNA差异表达及二甲双胍干预作用

王晨晔，丁彩飞

（浙江省中西医结合医院 生殖医学科，浙江 杭州 310003）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种以持续排卵障碍、高雄激素血症为特征的生殖内分泌紊乱性疾病。其发病率为6%～9%[1]，且50%～80%为多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗（polycystic ovary syndrome-insulin resistance，PCOS-IR）患者[2]。IR是一种多因性疾病，目前其发生机制尚未完全探明，多认为与遗传[3]、基因多态性[4-5]等因素密切相关。PCOS-IR患者多采用胰岛素增敏剂治疗，其中使用最广泛的为二甲双胍[6]，但二甲双胍改善IR的机制尚不十分明确。本研究采用微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）基因芯片技术联合定量RT-PCR的方法，筛选PCOS-IR患者血清差异性表达miRNA变化，并对其进行靶基因预测及靶基因功能富集分析，同时研究二甲双胍干预后miRNAs的表达。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2017年5月浙江省中西医结合医院生殖医学科就诊且符合试验条件者进行研究。其中确诊PCOS-IR患者6例为治疗组，年龄（28.7±3.3）岁；健康育龄期女性6例为健康对照组，年龄（29.2±3.9）岁。上述2组研究对象，于组内按随机数字表法各分为：基因芯片组3例和验证组3例。PCOS-IR治疗组于二甲双胍治疗前后、健康对照组入组后，均空腹采集10 mL受试者血清，-80 ℃保存备用，基因芯片组用miRNA基因芯片、验证组用RT-PCR检测。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 诊断标准 PCOS的诊断采用2003年鹿特丹标准[7]：①稀发排卵或无排卵；②临床高雄激素血症表现和（或）生化高雄激素血症；③至少一侧≥12个直径2～9 mm的卵泡，和（或）卵巢体积＞10 cm3。 与上述2 项相符并将其他因素诱发的高雄激素血症排除便可确诊。根据全国糖尿病防治组测算的采用胰岛素抵抗的稳态模型（homeostasis model assexxment-insulin resistcmce，HOMA-IR）[空腹胰岛素（fasting insulin，FINS，mU/L）×空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG，mmol/L）]/22.5）＞2.69判定为IR[8]。纳入标准：①符合诊断标准；②年龄20～40岁；③可配合治疗。排除标准：①其他引起排卵障碍的疾病者，如高泌乳素血症、卵巢早衰、垂体或下丘脑性闭经等；②器质性疾病或其他内分泌疾病；③合并有肝肾、脑血管、心血管和造血障碍等原发性疾病及精神病患者；④近3个月内服用过激素类药物如避孕药、糖皮质激素、胰岛素增敏剂者及已知的干扰性激素分泌和新陈代谢的药物，或参加其他临床试验的患者。

1.3 治疗方法 PCOS-IR治疗组：在月经来潮或撤药性出血后第1天开始早、中、晚餐中口服0.5 g盐酸二甲双胍片（格华止，中美上海施贵宝制药有限公司），每天3 次，治疗疗程3 个月。健康对照组：不予任何药物治疗。

1.4 miRNA基因芯片检测

1.4.1 试剂：RNA抽提试剂Invitrogen TRIzol（Cat.15596026）购自美国Invitrogen公司；RNA Later@RNA inhibitor、反转录酶SuperscriptTMIII reverse transcriptase购自美国Life Technologies公司；DNase、Easy Dilution和SYBR Green Premix Ex Taq II购自日本TaKaRa生物工程有限公司；Cy3-dCTP购自美国PerkinElmer公司；人miRNA表达谱芯片由美国LC Sciences公司提供（miRBase 21.0）。

1.4.2 总RNA提取纯化、芯片杂交、芯片数据分析：血清总miRNA的提取采用TRIzol试剂抽提，用超微量分光光度计Nano-drop1000测定吸光度值（D），抽提所得总RNA经Ag-ilent 2100 bioanalyzer（购自美国Agilent科技有限公司）电泳质检合格后使用miRNeasy迷你试剂盒（购自德国QIAGEN公司）获得，并采用紫外吸收测定法及变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性，纯化总RNA。采用miRCURYTM Array power标记试剂盒，用标记酶将Hy3TM或Hy5TM荧光基团标记miRNA，以得到用于芯片杂交的荧光探针。在标准条件下使用PhalanxTM的热收缩杂交袋将标记好的探针和miRCURYTM芯片杂交后，采用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，再转化为原始数据后使用配套软件进行LOWESS过滤归一化处理以及差异表达分析，得出差异性表达的miRNA。

1.4.3 实时RT-PCR验证基因芯片显示的差异性表达的miRNA：通过使用茎-环的反义引物混合物和AMV转录酶（大连TaKaRa公司）验证。所有的引物从昆明沃森生物科技公司购买，基于森格研究所公布的miRNA序列。

1.4.4 生物信息学分析：RT-PCR验证得到的显著差异性miRNAs，使用TargetScan、miRanda两款软件对显著性差异的miRNA分别进行靶基因预测，取此两款软件的交集作为差异miRNA的最终靶基因。差异miRNA靶基因预测的最后结果中显示miRNA对应的靶基因信息，并且对靶基因进行Gene Ontology（简称GO）和KEGG功能富集分析。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS20.0统计软件分析数据。计量资料以 ±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清芯片检测结果 与健康对照组比，PCOSIR治疗组治疗前有13个miRNA基因表达上调，6个miRNA基因表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；PCOS-IR治疗组治疗前与健康对照组差异聚类分析图，见图1。与PCOS-IR治疗组治疗前比，PCOS-IR治疗组治疗后有3个miRNA基因表达上调，13个miRNA基因表达下调，差异有统计学意义（P ＜0.05）；PCOS-IR治疗组治疗前和治疗后聚类分析，见图2。

2.2 特异性表达miRNA靶基因预测结果 PCOS-IR患者与健康对照组比较：hsa-miR-4472有3 755个靶基因、rrv-miR-rR1-7-5p有2 704个靶基因、hsa-miR-4433a-3p有4 206个靶基因、hvt-miR-H17-5p有486个靶基因、hsa-miR-5195-3p有2 871个靶基因、hvtmiR-H16-5p有2 010个靶基因、hsa-miR-6752-5p有3 293个靶基因、hsa-miR-4649-5p有827个靶基因、hsa-miR-4433b-3p有2 162个靶基因、hsa-miR-4463有2 013个靶基因。PCOS-IR患者二甲双胍治疗组治疗后与治疗前比较：hsa-miR-3620-5p有3 334个靶基因、rrv-miR-rR1-7-3p有486 个靶基因、rrvmiR-rR1-7-5p有253个靶基因、mghv-miR-M1-11-5p有2 204个靶基因、hsa-miR-6740-5p有2 313个靶基因、hsa-miR-148a-3p有2 880个靶基因、hsa-miR-7110-5p有3 331个靶基因、hsa-miR-29a-3p有2 707个靶基因。

图1 PCOS-IR治疗组治疗前和健康对照组聚类分析图

图2 PCOS-IR治疗组治疗前和治疗后聚类分析图

2.3 差异表达基因的GO富集分析 GO总共有3个ontology（本体），分别描述基因的分子功能（molecular function）、细胞的组成成分（cellular component）、参与的生物过程（biological process）。GO分析显示：差异表达基因与转录调控、信号转导、跨膜转运、细胞增殖、细胞凋亡、细胞代谢、细胞黏附、蛋白磷酸化、蛋白质运输、多细胞生物发育、凝血功能、神经传导等有关。

2.4 差异miRNA靶基因KEGG富集性分析 KEGG通路富集分析结果表明，差异表达miRNA参与显著表达的通路有：EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、Rap1信号通路、Wnt信号通路、前列腺癌通路、mTOR信号通路、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、MAPK信号通路，见图4。

图3 筛选出的miRNA靶基因对应的GO注释图

图4 差异miRNA靶基因KEGG富集分析图

3 讨论

PCOS的发病机制尚不十分清楚，目前研究证实PCOS发病主要与高雄激素血症、炎症免疫过度激活及遗传易感性[2-3]有关，常伴有不同程度的IR和代偿性高胰岛素血症[2]。二甲双胍是胰岛素增敏剂，被广泛用于治疗PCOS-IR患者，其作用机制尚不明确。本研究采用miRNA基因芯片技术联合定量RTPCR的方法，筛选PCOS-IR差异性表达的miRNA，及二甲双胍干预后miRNA的表达变化，并进行靶基因预测及靶基因功能富集分析。

本研究PCOS-IR治疗组治疗前与健康对照组差异miRNA聚类分析结果可以看出，miRNA可以有效区分2组样本。PCOS-IR治疗组治疗前与治疗后差异聚类分析结果可以看出，miRNA的表达在二甲双胍治疗前后发生了变化。然而，这些明显变化的miRNA 通过调控哪些靶基因而起作用还不十分明了。通过RT-PCR验证，PCOS-IR治疗组治疗前与健康对照组之间，得到10个差异表达变化的miRNA；PCOS-IR治疗组治疗前与治疗后之间，得到8个差异表达变化的miRNA。本次研究中miRNA的变化与前期的研究之间重叠的仅miR-29-3p和miR-4463，考虑这可能是由于来源于不同类型PCOS（PCOS和PCOS-IR）患者[9]。 近期关于下肢动脉硬化闭塞症的研究报道提出：miR-4463预测靶基因与细胞极性和迁移、细胞的紧密连接、脂质代谢、内吞作用、血管平滑肌收缩等功能相关，KEGG pathway分析则发现他们可能参与了胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、mTOR信号通路等，这与我们研究结果基本一致[9]。miR-29-3p是人体细胞生长和增殖调节的重要miRNAs，上皮性卵巢癌组织中miR-29-3p表达上调并可能发挥促癌作用[9]。GLUT4的表达也受miR-29-3p控制，它们可直接或间接调节GLUT4的表达从而参与糖尿病的发生与发展[9]。

在靶基因的预测方面，使用TargetScan、mi-Randa两款软件对显著性差异的miRNA分别进行靶基因预测，以此来探索PCOS-IR的发病机制及二甲双胍干预机制，筛查出的可能靶基因41 835个，其中PCOS-IR与正常对照组间预测到靶基因24 327个；PCOS-IR治疗前后预测到靶基因17 508个。GO是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（controlled vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。其中差异表达基因的GO富集分析发现：差异表达基因与转录调控、信号转导、跨膜转运、细胞增殖、细胞凋亡、 细胞代谢、细胞黏附、蛋白磷酸化、蛋白质运输、多细胞生物发育、凝血功能、神经传导等有关。

在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在显著性差异表达基因中显著性富集的 Pathway。在差异miRNA靶基因KEGG富集性分析过程中，通过将这些基因与对PCOS-IR的发生和二甲双胍治疗密切相关的信号通路基因相交集，最后得到与PCOS-IR和二甲双胍治疗相关性更大的miRNA的靶基因。表达显著的通路有：EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、Rap1信号通路、wnt信号通路、前列腺癌通路、mTOR信号通路、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、MAPK信号通路。匹配到单个通路的具有显著性差异的基因数：EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性61个基因、Rap1信号通路145个基因、wnt信号通路103个基因、前列腺癌67个基因、mTOR信号通路110个基 因、cAMP信号通路140个基因、磷脂酰肌醇信号系统75个基因、MAPK信号通路177个基因。通过这种方法，缩小了查找范围，共得到878个与PCOS-IR及其二甲双胍治疗更相关的靶基因。

通过文献挖掘发现：实验结果预测靶基因功能涉及多种疾病，包括肺癌、前列腺癌、子宫内膜异位症、子宫内膜癌、卵巢癌、脂肪肝。可见PCOS-IR的发病机制除了特定的基因改变外，还与胰岛素相关的信号通路如：mTOR信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、MAPK信号通路密切相关[10]。此外wnt信号通路的发现，推测wnt信号通路异常可能是PCOS-IR患者子宫内膜增生、子宫内膜癌和卵巢癌高危的可能机制[11]。PCOS患者的cAMP信号通路与促进睾酮生成、肝脏脂肪变性和葡萄糖稳态密切相关[12]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、Rap1信号通路和前列腺癌通路在本病中的发现进一步证实二甲双胍除了改善葡萄糖代谢外，还被证明在抗肿瘤如肺癌等肿瘤的可能作用机制[13-14]。

综上，本研究报告了非侵入性血清miRNA谱区分PCOS-IR患者和健康对照者，以及二甲双胍治疗前后miRNA的变化，肯定miRNA参与PCOS-IR的发病和二甲双胍治疗过程，并通过生物信息学方法缩小了miRNA靶基因的查找范围和功能分析，为PCOS-IR的发病和二甲双胍治疗机制的认识提供了依据，为今后PCOS-IR治疗靶点选择提供新的思路。