结直肠癌组织浸润免疫细胞组成及特征

吴林峰，孙永吉，叶乐乐，沈贤，薛向阳，沈淑蓉

（1.温州市中西医结合医院 肿瘤科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学 第一临床医学院，浙江 温州 325035；3.温州医科大学 基础医学院 微生物学与免疫学教研室，浙江 温州 325035；4.温州医科大学附属第二医院 胃肠外科，浙江 温州 325027）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最常见的肿瘤之一，在全球因癌症死亡的原因中居第二位[1]。随着医疗水平的提高，尽管癌症的存活率得到了极大的提高，但CRC的发病率及病死率仍较高，晚期患者的预后仍然很差[2]。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的免疫特征已经被列入肿瘤十大特征之一[3]，一方面能够在患者临床预后中发挥作用，另一方面，还能预测患者临床化疗或者放疗等的临床疗效[4-5]。因此，对TME中免疫细胞的种类和分布的研究，具有重要临床意义[6-9]。由于健康人的组织标本的获得存在很大难度，近年来对于TME的研究通常是将癌症患者的肿瘤组织及配对的正常组织如癌旁组织进行对比，很少有研究探讨肿瘤组织与健康人组织的差异。

现阶段用于TME研究的主要技术手段有免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）和流式细胞术（flow cytometry，FCM）2种，但这些技术存在局限性。IHC一次可以评估很少的免疫细胞类型，而FCM明确区分某些细胞类型通常基于几种标记蛋白，其受荧光通道数量的限制。随着计算机科学和互联网技术的进步，生物信息学得到了快速的发展，各种新的生物信息分析技术不断涌现，CIBERSORT就是其中之一[10]。CIBERSORT采用对大量基因表达数据进行去卷积的一种复杂的算法，可以将组织中基因表达谱数据转化为组织中各种免疫细胞类型所占的比例。

本研究通过下载GEO数据库51 例健康人以及333例CRC患者的基因表达谱数据，通过CIBERSORT工具转化为免疫细胞类型及其占比情况。从TME角度出发，探讨健康人与CRC组织在免疫细胞组成及含量上的差异，为相关研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究人群 在GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载不同疾病状态的结直肠组织样本的基因表达谱数据，其中，CRC的数据来自数据集GSE4107（n=12），GSE21510（n=124），GSE4045（n=37），GSE25071（n=46），GSE30540（n=35），GSE32323（n=17），GSE35896（n=62），共333例；正常结直肠组织的数据来自数据集GSE4107（n=10），GSE21510（n=24），GSE32323（n=17）共51例。

1.2 免疫细胞特征 CIBERSORT转换方法是通过CIBERSORT函数，对复杂组织（如大体积实体肿瘤）的转录组测序表达谱进行统计分析，通过反褶积方法去噪及去除未知混合物含量，来估计22种免疫细胞亚群的相对比例。根据每个测序样本的表达谱数据，分析其中特异的547个基因的相对表达量来预测22种免疫细胞的占比情况。免疫细胞在健康人和CRC患者的结直肠组织中的浸润总比例为100%，选择P＜0.05的数据进行后续分析。见表1。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0软件进行统计分析。正态分布的连续变量数据以 ±s表示，进行t检验，非正态分布的连续变量数据通过非参数U检验进行分析；等级变量通过χ2检验及秩和检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC与正常结直肠组织TME的特征 我们通过CIBERSORT转换获得51例健康人与333例CRC患者22种免疫细胞的浸润比例。结果显示，在健康人中，Bn、plasma cells、CD4+Tmr、Tfh、M0、M2、Ma在结直肠组织中占的比例较多，均在5%以上；Bm、CD8+T、tregs、γδT、NKr、M1、DCr、Mr浸润占比在1%以上；CD4+Tn、CD4+Tma、NKa、Mono-cytes、DCa、eosinophils、neutrophils所占比例较少，均小于1%。在CRC患者的肿瘤组织中，plasma cells、CD4+Tmr、CD4+Tma、Tfh、M0、M1、M2、Ma在结直肠肿瘤微环境中占的比例较多，均在5%以上；Bn、Bm、CD8+T、CD4+Tn、tregs、γδT、NKr、NKa、DCr、DCa、Mr、neutrophils浸润占比在1%以上，但小于 5%；monocytes、eosinophils所占比例较少，均小于1%（见图1）。

2.2 CRC与正常结直肠组织浸润免疫细胞的差异

T细胞在CRC组织中的浸润百分数为（35.7± 13.8）%，B细胞为（14.9±10.3）%，均低于健康人的结直肠组织（P＜0.01）；macrophages、DCs、mast cells、neutrophils在CRC中的浸润比例高于正常组织（P＜0.01）；NK cells、monocytes和eosinophils在肿瘤组织和正常组织中差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。为进一步探究免疫细胞在CRC与正常组织中浸润的差异，我们对T细胞、B细胞、macrophages、NK cell、DCs和mast cell亚型进行分析。在T细胞亚型中，CD4+Tmr、Tfh和γδT在正常组织中的浸润百分数明显高于CRC组织 （P＜0.01）；CD4+Tma在CRC中浸润程度明显高于正常组织（P＜0.01）；CD8+T、CD4+Tn和tregs在CRC组织与正常组织中差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。在B细胞亚型中，Bn在正常组织中的浸润比例高于CRC组织（P＜0.01），而Bm和plasma cells在2组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。在巨噬细胞亚型中，M0、M1在CRC中浸润的程度高于正常组织（P＜0.01），M2在CRC组织与正常组织差异无统计学意义（P＞0.05）；在CRC组织中，M2亚型在总巨噬细胞中所占比例下降（P=0.003）。见图5。在DCs的亚型中，DCr和DCa在CRC组织的浸润比例均高于正常组织（P＜0.01）；在NK的亚型中，NKr和NKa在肿瘤组织与正常组织间差异无统计学意义（P＞0.05）；在mast cells的亚型中，Ma在肿瘤组织的浸润比例高于正常组织（P＜0.01），而Mr差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

表1 健康人和CRC患者结直肠组织中免疫细胞占比情况

图1 CRC与正常结直肠组织中的免疫细胞组成

3 讨论

图2 9种免疫细胞在CRC与正常组织中浸润的差异

图3 CRC与正常组织中T细胞亚型分析

许多研究发现，肿瘤组织浸润的免疫细胞对于肿瘤的发生发展具有重要作用[11-12]，并影响肿瘤对治疗的反应[3，13-14]。本研究通过CIBERSORT技术，获得健康人和CRC患者的结直肠组织中浸润的免疫细胞的情况，发现T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞在2组间差异有统计学意义。我们观察到T细胞与B细胞在CRC患者组织中的浸润比例要低于正常组织，并且发现T细胞浸润减少主要是因为Tfh，γδT浸润减少，B细胞浸润减少主要是因为Bn浸润减少。有研究表明[15-17]，在CRC患者中，T细胞与B细胞的浸润对患者的预后具有积极地影响，本研究进一步阐明了T细胞与B细胞在TME中的浸润趋势。ROHRUDILOVA等[18]对肝脏组织进行过类似的研究，发现在肝细胞癌组织中浸润的T细胞与B细胞数量均高于正常组织，这与本研究结果存在差异。肿瘤细胞与TME间存在复杂的相互作用[19]，可能在不同的癌症中，不同的组织中，TME也存在差异。

图4 CRC与正常组织中B细胞亚型分析

图5 CRC与正常组织中巨噬细胞亚型分析

图6 CRC与正常组织中肥大细胞、树突状细胞和NK细胞亚型分析

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是炎症和癌症领域最重要的参与者之一，主要分为M1型和M2型巨噬细胞，M1型发挥抗肿瘤作用，而M2型发挥促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用[20]。临床研究证实，M2型TAM浸润的数量与肿瘤患者的预后呈负相关，肿瘤组织中的M2型巨噬细胞大量存在提示预后不良[21-22]。本研究发现，巨噬细胞在CRC患者的结直肠组织中浸润增多，进一步分析发现，增多的免疫细胞主要是M0与M1，M2在CRC与正常人的结直肠中浸润程度无差别，且在CRC中M2型巨噬细胞比例下降。这对于患者的预后是一个有利信号。

中性粒细胞在肿瘤组织中的浸润百分比大于正常组织。有研究表明，在胃癌和CRC中，中性粒细胞在肿瘤组织中的浸润程度要高于肿瘤基质[23]，提示中性粒细胞趋向在肿瘤组织中浸润，但其研究仅将肿瘤患者的肿瘤组织与肿瘤基质对比，本研究将CRC与健康人的结直肠组织进行对比，发现在CRC患者肿瘤组织中中性粒细胞的浸润比例较高，进一步表明在CRC组织中可能存在某种机制，促进中性粒细胞的浸润。然而在肝细胞癌中，肿瘤患者与正常人的中性粒细胞的浸润情况并无差别[18]，提示对于不同的类型的癌症，TME中中性粒细胞的浸润情况有所不同。有研究报道，在不同组织中中性粒细胞浸润与预后的关系不同，肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TAN）的浸润对于头颈癌[24]、肾细胞癌[25]、黑色素瘤[26]、肝细胞癌[27]和肝内胆管癌[28]患者的预后是一个有利因素，对于乳腺癌[29]、胃癌[30]、结直肠癌[31-32]患者是一个不利因素。

此外，本研究还发现Mr在CRC肿瘤组织与正常组织中的浸润比例差异无统计学意义，而Ma在肿瘤组织中的浸润比例要高于正常组织，提示肥大细胞在肿瘤组织中更趋向于活化状态，其活化的机制尚不清楚。虽然肥大细胞有多种不同的激活方式[33]，但CIBERSORT是以IgE介导活化的肥大细胞的基因表达特征作为Ma的筛选模板[10]，即筛选出来的活化的肥大细胞均是通过IgE介导激活的。有研究表明，IgE介导的肥大细胞活化可能在抗肿瘤免疫中起重要作用[34-35]，IgE介导的免疫细胞活化也是目前免疫治疗的一个重要靶点[36]。因此，CRC中IgE介导的肥大细胞活化增多可以增强机体的抗肿瘤反应，有利于抑制肿瘤生长。此外，CD4+记忆T细胞和NK细胞在CRC的TME中更趋向于活化状态，具体机制尚不清楚。

然而在临床中，正常人的大肠组织标本很难获得，所以在临床验证方面，本研究的进一步展开目前存在一定的难度，并且当前的免疫技术对于其中许多免疫细胞的检验依旧存在瓶颈，例如难以准确区分各种亚型的T细胞。因此临床验证方面的缺失是本研究的最大遗憾，希望能在将来得以解决。

综上，本研究通过CIBERSORT方法，分析了CRC患者和健康人大肠组织中22 种免疫细胞的浸润情况，获得了这些免疫细胞在两者中的分布趋势，其中T细胞、B细胞在肿瘤组织中浸润较少，肥大细胞与CD4+记忆T细胞在TME中趋向于活化，希望这些发现能为相关研究提供参考与思路。